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外来DNAに対するホスト細胞のエピジェネティック制御機構の解明

阐明宿主细胞对外源DNA的表观遗传控制机制

基本信息

批准号：
15K06918
负责人：
菅谷茂
金额：
$ 3.24万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-01 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ウィルス感染などにより誘導されるエピゲノム異常と疾患の関わりが示唆されており、分子機構の解明が希求されている。Epstein-Barrウイルスはホスト細胞感染時にエピソームを形成し、ウイルスゲノム自身もホストゲノムDNAもエピゲノム変化を生じる。その分子機構を明らかにするため、エピソーマル型プラスミドをホスト細胞に導入し、エピソームに対するエピゲノム変化およびその原因候補タンパクの探索を行った。プラスミドは、oriP配列とEBNA1遺伝子、さらにGFP遺伝子と薬剤耐性遺伝子を導入した11kbのエピソーマル型プラスミドEB-Multi GFP（以下EBM）を用いた。GFPタンパクは、薬剤選択下では、高発現状態が維持されたが、薬剤非選択下では様々な発現レベルを示す集団が観察された。エピソームのDNAメチル化状態についてGFP遺伝子領域を含め、パイロシークエンス法を用いて解析し、メチル化の誘導を同定した。次にEBNA1にFLAGタグを結合したFLAG-EBNA1タンパクを発現した293T細胞に、ビオチンラベルしたEBMプラスミドを導入し、エピソームに結合するタンパクの同定を行った。アビジンビーズによりEBM導入６日後の細胞からビオチンラベルDNAを回収し、これに結合するタンパクを抽出した。抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロティング解析により、抽出物中のFLAG-EBNA1タンパクをコントロールとして確認した。銀染色では複数のバンドを認め、LC-MS/MSによるEBM結合タンパクのプロテオミクス解析を行った。同定した候補タンパクのうちp53タンパクについては、ウエスタン法によりEBMプラスミドへの結合が確認された。さらに、shRNAによりp53発現を抑制した細胞では、EBMプラスミドのGFP発現の増大が観察され、p53がEBMプラスミドの発現制御に関与していることが示唆された。

ウィルス infection などにより induced されるエピゲノム abnormality and disease のGuan わりが说憆されており, molecular mechanism の见明が西愿されている. The formation of cysts during infection of Epstein-Barr cellsし、ウイルスゲノム itself もホストゲノムDNAもエピゲノム変化を生じる.そのmolecules structureを明らかにするため、エピソーマルtype プラスミドをホストcellにINTRODUCTIONし.プラスミドは, oriP array and EBNA1 residue, さらにGFP residue and 薬剤Patience left 伝子を imported した 11kb のエピソーマル type プラスミドEB-Multi GFP (below EBM) is used. GFPタンパクは, 薬艤选択下では, 高発existingstatusmaintainされたが, 薬剤不选択下では様々な発开レベルをshow す集団が観看された.エピソームのDNA modified state についてGFP legacy subfield をcontaining め,パイロシークエンス法を用いてanalyticし,メチル化のinducingを同定した. The combination of FLAG-EBNA1 and FLAG-EBNA1 is present in 293T cells. , ビオチンラベルしたEBMプラスミドを Import し, エピソームにcombination するタンパクの同定を行った.アビジンビーズによりEBM is introduced into 6 future cells, からビオチンラベルDNA is recovered, and これに is combined with するタンパクを to be extracted. Anti-FLAG antibody analysis kit, extract中のFLAG-EBNA1タンパクをコントロールとしてConfirmationした. Silver staining and identification, LC-MS/MS and EBM combined with silver staining and analysis. Tongding した candidate タンパクのうちp53 タンパクについては、ウエスタン法によりEBMプラスミドへのcombinationがconfirmationされた.さらに, shRNA によりp53発appears to inhibit したcells では, EBM プラスミドのGFP 発appears The のincreasing large が観看され, p53 がEBM プラスミドの発existing control に关 and していることが时攆された.