ＰＰＭ１ホスファターゼＩＬＫＡＰによる癌抑制機構の解明

細胞の足場非依存的増殖能の獲得や、アポトーシス耐性は細胞癌化に強く関わっており、その分子機構の解明は効果的な癌治療に必須である。ILKAPはマンガンイオン依存的に酵素活性を持つSer/Thrホスファターゼであり、癌抑制タンパク質としての機能が示唆されている。ILKAPはN端側に特有のrepeat配列を有している。しかしながら、ILKAPの標的基質およびrepeat配列の機能は明らかになっておらず、その制御機構は不明である。本研究では、「PPM1ホスファターゼILKAPの細胞癌化抑制機構の解明」を目的とする。本年度は、基質の同定法の開発およびILKAPのrepeat配列の解析を進めた。昨年度までに、モデルホスファターゼとしてPPM1Aを選択した基質同定法の開発を進めている。細胞内基質に対する基質同定法の基質捕捉を評価するため、HEK293細胞懸濁液に対して捕捉を行い、銀染色によって捕捉されたタンパク質を解析した。捕捉条件下である特異的二価イオン存在下において捕捉を実施したところ、特異的二価イオン存在下で捕捉を行った時だけ観察されるバンドが見出され、基質同定法による基質の捕捉が示唆された。ILKAPのRepeat配列をペプチドとして合成し、ILKAPの脱リン酸化活性におよぼす影響を解析した。Repeat配列は繰り返し配列が1回だけのsingle repeatペプチド、繰り返し配列が2回含まれるrepeatペプチドの2種類を化学合成した。single repeatペプチドに関して、酵素と混合した際および基質と混合した際に別々の異なる反応が見られた。酵素と混合した際はILKAPの脱リン酸化活性に全く影響を与えなかったが、基質と混合した際にはILKAP脱リン酸化活性を上昇させ、Single repeatペプチドがある一定の濃度に達するまでは上昇、それ以降の濃度では効果が下がるという結果となった。基質と混合した際に効果が現れたことから、ILKAP repeat 配列は基質との結合能に関与している可能性が示唆された。

細胞の足場非依存的増殖能の獲得や、アポトーシス耐性は細胞癌化に強く関わっており、その分子機構の解明は効果的な癌治療に必須である。ILKAPはマンガンイオン依存的に酵素活性を持つSer/Thrホスファターゼであり、癌抑制タンパク質としての機能が示唆されている。ILKAPはN端側に特有のrepeat配列を有している。しかしながら、ILKAPの標的基質およびrepeat配列の機能は明らかになっておらず、その制御機構は不明である。本研究では、「PPM1ホスファターゼILKAPの細胞癌化抑制機構の解明」を目的とする。本年度は、基質の同定法の開発およびILKAPのrepeat配列の解析を進めた。昨年度までに、モデルホスファターゼとしてPPM1Aを選択した基質同定法の開発を進めている。細胞内基質に対する基質同定法の基質捕捉を評価するため、HEK293細胞懸濁液に対して捕捉を行い、銀染色によって捕捉されたタンパク質を解析した。捕捉条件下である特異的二価イオン存在下において捕捉を実施したところ、特異的二価イオン存在下で捕捉を行った時だけ観察されるバンドが見出され、基質同定法による基質の捕捉が示唆された。ILKAPのRepeat配列をペプチドとして合成し、ILKAPの脱リン酸化活性におよぼす影響を解析した。Repeat配列は繰り返し配列が1回だけのsingle repeatペプチド、繰り返し配列が2回含まれるrepeatペプチドの2種類を化学合成した。single repeatペプチドに関して、酵素と混合した際および基質と混合した際に別々の異なる反応が見られた。酵素と混合した際はILKAPの脱リン酸化活性に全く影響を与えなかったが、基質と混合した際にはILKAP脱リン酸化活性を上昇させ、Single repeatペプチドがある一定の濃度に達するまでは上昇、それ以降の濃度では効果が下がるという結果となった。基質と混合した際に効果が現れたことから、ILKAP repeat 配列は基質との結合能に関与している可能性が示唆された。