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Ｂ型肝炎ウイルス感染の蛍光可視化モデルの樹立と肝炎免疫応答機構の探索

乙型肝炎病毒感染荧光可视化模型的建立及肝炎免疫反应机制的探索

基本信息

批准号：
16J11897
负责人：
犬塚義
金额：
$ 2.58万
依托单位：
National Center for Global Health and Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J11897/
关键词：
蛍光遺伝子発現 Hydrodynamic injection 蛍光遺伝子 HBV

项目摘要

Nanoluc/HBV plasmid(Cancer Sci. 2015;106:1616-24)のNanolucを蛍光遺伝子に置き換えて蛍光遺伝子発現が確認されるか実験を始めた。蛍光遺伝子はTurbo-RFPを選択した。Nanoluc直後のHBVのうちpreS1遺伝子領域のpromoterより上流の100bp程度を削った。In-Fusion HD cloning kitを用いて制限酵素配列を排除して蛍光遺伝子挿入を行い、新たに蛍光遺伝子挿入HBV plasmid（Turbo-RFP HBV）を作成した。HepG2 細胞にplasmid をtransfectionさせると、Turbo-RFP では10-20%程度の細胞に蛍光発色がみられた。また、Turbo-RFP HBV発現細胞上清でHBs抗原、HBe抗原のELISA 測定法でHBV タンパクが確認された。そこで、このTurbo-RFP挿入HBV(以下、RFP-HBV)を用いて感染実験を行った。粒子形成させる方法として、RFP HBVのtransfection のみでは、HBV粒子形成に必要なタンパクを全ては補いきれないため、HBVのε構造配列に変異を2 か所挿入したHBV-⊿ε plasmidをco-transfectionさせることにより、HBV構造タンパクの供給を行った。14日間細胞培養し、7日間おきに上清を回収し、超遠心にて100 倍濃縮して感染実験を行ったが、感染粒子の形成は確認できなかった。次に、このplasmidを用いて、Hydrodynamic injectionをC57BL/6 mice に行ったところ、肝内に蛍光発色肝細胞の存在が確認された。なお、空ベクターを用いてHydrodynamic injection を行ったコントロールマウスと比較しても炎症細胞浸潤などは確認されなかった。

Nanoluc/HBV plasmid(Cancer Sci. 2015;106:1616-24) Nanoluc Turbo-RFP selection The promoter of HBV DNA in the upstream of Nanoluc DNA is 100bp. In-Fusion HD cloning kit is used to limit enzyme alignment, eliminate light transfer, and create new light transfer into HBV plasmid (Turbo-HBV RFP). HepG2 cells have 10-20% of the cell's light emission due to plasmid transfection and Turbo-RFP. HBV antigen was identified by ELISA assay for HBs antigen and HBe antigen in supernatant of Turbo-RFP HBV developing cells. Turbo-RFP is introduced into HBV(hereinafter, RFP-HBV). The method of particle formation includes: RFP HBV transfection; HBV particle formation; HBV structure co-transfection; HBV particle formation; and HBV structure co-transfection. 14 days of cell culture, 7 days of supernatant recovery, ultra-remote concentration of 100-fold infection, infection particle formation and confirmation The presence of C57BL/6 mice and liver cells was confirmed by the use of plasmid and Hydrodynamic injection. The inflammatory cell infiltration was confirmed by comparison with the use of Hydrodynamic injection.