Ｂ型肝炎ウイルス感染の蛍光可視化モデルの樹立と肝炎免疫応答機構の探索

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Nanoluc/HBV plasmid(Cancer Sci. 2015;106:1616-24)のNanolucを蛍光遺伝子に置き換えて蛍光遺伝子発現が確認されるか実験を始めた。蛍光遺伝子はTurbo-RFPを選択した。Nanoluc直後のHBVのうちpreS1遺伝子領域のpromoterより上流の100bp程度を削った。In-Fusion HD cloning kitを用いて制限酵素配列を排除して蛍光遺伝子挿入を行い、新たに蛍光遺伝子挿入HBV plasmid（Turbo-RFP HBV）を作成した。HepG2 細胞にplasmid をtransfectionさせると、Turbo-RFP では10-20%程度の細胞に蛍光発色がみられた。また、Turbo-RFP HBV発現細胞上清でHBs抗原、HBe抗原のELISA 測定法でHBV タンパクが確認された。そこで、このTurbo-RFP挿入HBV(以下、RFP-HBV)を用いて感染実験を行った。粒子形成させる方法として、RFP HBVのtransfection のみでは、HBV粒子形成に必要なタンパクを全ては補いきれないため、HBVのε構造配列に変異を2 か所挿入したHBV-⊿ε plasmidをco-transfectionさせることにより、HBV構造タンパクの供給を行った。14日間細胞培養し、7日間おきに上清を回収し、超遠心にて100 倍濃縮して感染実験を行ったが、感染粒子の形成は確認できなかった。次に、このplasmidを用いて、Hydrodynamic injectionをC57BL/6 mice に行ったところ、肝内に蛍光発色肝細胞の存在が確認された。なお、空ベクターを用いてHydrodynamic injection を行ったコントロールマウスと比較しても炎症細胞浸潤などは確認されなかった。