バイオ3Dプリンタを用いた間葉系幹細胞構造体による腱・靱帯組織の再生技術の開発

使用生物 3D 打印机使用间充质干细胞构建体开发肌腱和韧带组织再生技术

• 批准号: 16K10864
• 负责人: 岡田 貴充
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16K10864/
• 关键词: 3Dバイオプリンタ; 腱・靱帯組織再生; ヒト皮膚線維芽細胞; 3D バイオプリンター; 牽引培養; バイオ3Dプリンタ; 間葉系幹細胞

ヒト皮膚線維芽細胞を96well plateで培養すると、接着細胞である皮膚線維芽細胞は細胞同士が接着しあって、36時間の培養にて自然と球状の凝集塊を形成し、直径500~600μmのスフェロイドとなった。このスフェロイドをコンピュータ上で構造体の配列を設定しまし、3D バイオプリンタを用いてスフェロイドを一つずつ剣山様ニードルアレイに刺していきスフェロイドを積み上げ、リング上の組織を作製した。自作した牽引培養器を用いて組織を牽引培養した。牽引群と非牽引群を設定し、ヘマトキシリンエオジン染色とマッソントリクロム染色を用いた組織像、腱成熟度スコア、細胞外基質マーカーとしてtenascin C、腱細胞マーカーとしてscleraxisを免疫染色にて評価した。牽引群では、4週では、核形態、細胞配列、細胞密度に非牽引群と比して変化は認めなかったが、8週では伸張した核を有す細胞の比率が増え、牽引方向と平行に配列する細胞の割合も増加した。牽引群では4週で青色に染まるコラーゲン線維の増生を認めたが、線維の走行は牽引方向だけでなく非牽引方向にも認め秩序性に欠けた配列であった。一方8週では組織全体の内、青色のコラーゲン線維が占める割合が増え、牽引方向と平行に秩序性をもって配列していた。腱成熟度スコアでは牽引群では4週より8週の方が有意に高く、培養期間と共にスコアの向上を認めたが、非牽引群では4週と8週で有意差はなく、牽引群8週は非牽引群8週に比してスコアが有意に高い結果となった。tenascin Cの免疫染色では両群共に４週、８週で発現を認めた。scleraxisの免疫染色では、培養4週・8週共に非牽引群より牽引群にて強い発現を認めまた。以上より牽引培養した組織は腱の非常に類似した組織となっており、足場を用いない方式で腱組織の再生が可能である事が示された。

当人皮肤成纤维细胞被培养在96个井板中时，粘附细胞的细胞变得彼此粘附，经过36小时的培养，自然形成球体，导致直径为500-600μm的球体。将结构排列在计算机上，并使用3D Bioprointer将球体插入肯山针阵列中，将球体插入kenzan针阵列中，以将球体堆放到kenzan针阵列中，从而在环上形成组织。使用自制牵引孵化器培养组织。设置了牵引组和非牵引力组，并使用苏木精灵曙红染色和Masson三色染色，肌腱成熟度得分，替纳斯辛C作为细胞外基质标记物，以及作为腱细胞标记物通过免疫抑制来评估肌腱成熟度。在牵引组中，与非交易组相比，在4周时核形态，细胞对齐或细胞密度没有观察到任何变化，但是在8周时，具有扩展核的细胞比例增加，并且平行于牵引方向平行的细胞比例也增加了。牵引组显示了在4周时染色蓝色的胶原蛋白纤维的生长，但不仅在牵引力方向上，而且在非牵引方向上也看到了纤维，并且排列缺乏顺序。同时，在8周时，在整个组织中占蓝色胶原纤维的比例增加，并且它们被安排为有序地平行于牵引力方向。牵引力组的肌腱成熟度得分明显高于第4周，并且在培养期间的得分得到了提高，但是在非牵引力组的第4周和第8周之间没有显着差异，并且在牵引力组的第8周中的分数明显高于在牵引力组的第8周。在Tenascin C的免疫染色中，在4和8周的两组中都观察到表达。在硬化性的免疫染色中，在培养的4周和8周的牵引力组中观察到强烈的表达，而不是在非交易组中观察到强烈的表达。从上面，牵引中培养的组织与肌腱非常相似，并且表明可以使用无脚手架的方法来实现肌腱组织的再生。

项目成果

9.3Dバイオプリンタを用いて作成した皮膚線維芽細胞細胞構造体の牽引培養による腱・靱帯組織の作成

9. 通过使用 3D 生物打印机创建的皮肤成纤维细胞结构的牵引培养来创建肌腱和韧带组织

• 发表时间: 2018
• 作者: 中西芳応;岡田貴充;竹内直英;千住隆博;中山功一;中島康晴
• 通讯作者: 中島康晴

2.ヒト皮膚線維芽細胞細胞構造体の牽引培養による腱板組織の再生

2. 通过人真皮成纤维细胞结构的牵引培养来再生肩袖组织

• 发表时间: 2018
• 作者: 中西芳応;岡田貴充;竹内直英;小薗直哉;千住隆博;中山功一;中島康晴
• 通讯作者: 中島康晴