Runx2/Cbfa1の核内移行制御を基盤とした骨芽細胞分化誘導技術の創生

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間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化には,転写因子「Runx2/Cbfa1」の発現およびその核内移行が必須である。Runx2/Cbfa1の転写活性が行われる際,Runx2/Cbfa1は輸送担体によって細胞質から核内に輸送されるが,その詳細なメカニズムについては十分に解析されていない。本研究は,骨芽細胞分化におけるRunx2/Cbfa1の核内移行機構を解明し,核内移行を担う輸送因子を人為的に操作することにより,骨組織の再生を誘導する技術を開発することを目的としている。本年度は,細胞にRunx2/Cbfa1を強制発現させる系を確立するために,レンチウイルスGateway system (invitrogen)を用いた遺伝子導入法に用いるベクターの構築を行った。完全長マウスcbfa1をPCRでクローニングし,Gateway systemのエントリーベクターを作製した。このエントリーベクターを用いてLR反応によって発現ベクター(pcDNA3.1/nV5-DEST)を作製し,これをリポフェクタミン法によって,HEK293A細胞に導入した。その後,PCRおよびウエスタンブロッティングを用いてRunx2/Cbfa1が実際に細胞に恒常的に発現していることを確認した。次に,この発現ベクターをマウス由来間葉系幹細胞に同様に導入し,骨芽細胞分化が促進することを,RT-PCR解析,アルカリフォスファターゼ染色およびフォンコッサ染色を用いて確認した。今後,Runx2/Cbfa1の核移行シグナルと考えられる領域(basic domain)を中性アミノ酸配列に変異させたRunx2/Cbfa1の発現ベクターを作製する予定であったが,申請者の辞職に伴う科学研究費応募資格の喪失により実験を終了するに至った。