APC癌抑制遺伝子産物による細胞運動制御機構の解明

癌抑制遺伝子産物APCとその移動を補助するタンパク質Kinesin-2との複合体の立体構造を決定するとともに、細胞運動の分子メカニズムを理解することが目的である。また、変異型APCとKinesin-2の複合体が細胞の浸潤・転移を引き起こす分子機構を解明し、決定した立体構造に基づいて結合候補化合物の探索、及び新たな分子標的抗癌剤や浸潤・転移抑制薬への応用に発展させることを目標としている。平成24年度の実験では、APCタンパク質とKinesin-2を構成するKAP3、KIF3A、KIF3Bの調製法の確立を開始した。APCについては、大腸菌無細胞発現系を用いて数種類の断片を合成し、精製条件を決定した。APCと直接結合するKAP3についても昆虫細胞を用いた発現系と大腸菌無細胞発現系の両方を試し、大量発現と精製の条件を決定した。KIF3AとKIF3Bについては、昆虫細胞を用いた発現系を作製し、発現の検討を行った。タグ無しの状態でKIF3AとKIF3Bタンパク質の収量が低かったため、ポリHisタグを用い、発現を再検討した。得られたAPC単体、KAP3単体及びAPC/KAP3複合体の結晶化条件のスクリーニングを行った結果、いくつかの条件で微結晶を得た。それらの条件を基に、より大きな結晶を得るために、スクリーニング条件の拡張や、試料のバッファーの種類を変更して、再びスクリーニングを行った。多少結晶が大きくなったが、高分解能データを得るため、結晶化方法の変更、結晶化時のアガロース添加、シーディングなどを試みた。

癌抑制遺伝子産物APCとその移動を補助するタンパク質Kinesin-2との複合体の立体構造を決定するとともに、細胞運動の分子メカニズムを理解することが目的である。また、変異型APCとKinesin-2の複合体が細胞の浸潤・転移を引き起こす分子機構を解明し、決定した立体構造に基づいて結合候補化合物の探索、及び新たな分子標的抗癌剤や浸潤・転移抑制薬への応用に発展させることを目標としている。平成24年度の実験では、APCタンパク質とKinesin-2を構成するKAP3、KIF3A、KIF3Bの調製法の確立を開始した。APCについては、大腸菌無細胞発現系を用いて数種類の断片を合成し、精製条件を決定した。APCと直接結合するKAP3についても昆虫細胞を用いた発現系と大腸菌無細胞発現系の両方を試し、大量発現と精製の条件を決定した。KIF3AとKIF3Bについては、昆虫細胞を用いた発現系を作製し、発現の検討を行った。タグ無しの状態でKIF3AとKIF3Bタンパク質の収量が低かったため、ポリHisタグを用い、発現を再検討した。得られたAPC単体、KAP3単体及びAPC/KAP3複合体の結晶化条件のスクリーニングを行った結果、いくつかの条件で微結晶を得た。それらの条件を基に、より大きな結晶を得るために、スクリーニング条件の拡張や、試料のバッファーの種類を変更して、再びスクリーニングを行った。多少結晶が大きくなったが、高分解能データを得るため、結晶化方法の変更、結晶化時のアガロース添加、シーディングなどを試みた。