神経芽腫がん幹細胞の幹細胞特性維持と分化障害の分子機構解明

阐明神经母细胞瘤干细胞维持干细胞特性和分化受损的分子机制

• 批准号: 24791080
• 负责人: 柳生 茂希
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-24791080/
• 关键词: 神経芽腫; がん幹細胞; BMI1; NOTCH

神経芽腫細胞中に存在し、化学療法抵抗性や難治性に強くかかわる、がん幹細胞を治療標的とするためには神経芽腫がん幹細胞の幹細胞特性の維持機構や分化障害機構の解明が急務である、我々は、神経芽腫細胞に高発現し、神経幹細胞の幹細胞特性維持に密接にかかわるBMI1遺伝子と、経芽腫細胞で活性化され、神経幹細胞の分化に密接にかかわるNOTCH経路の機能解析を行うことで、神経芽腫がん幹細胞を治療標的とした新規治療法解明のための分子標的を探索することを本研究の目的とした。NB細胞株をもちいたEMI1遺伝子の発現解析では、M3細胞株は一様にBMI遺伝子の高発現が認められた。また、NOTCH経路関連遺伝子であるASCL1、HES1も同様に高発現していた。NB細胞株であるKP-N-RTEM1、SH-SY5Y細胞株に対し、AIRA1μMで分化誘導を行ったところ、AIRA投与開始2時間後より、ASCL1の、6時間後ごろよりphox2bの著しい発現抑制が見られたのち、神経突起を延長させ分化が誘導された。また、分化に伴いBMI1遺伝子の発現低下が観察された。さらに、同細胞株にNotch阻害剤であるγセクレターゼ(GSI)を投与したところ、HES1遺伝子の発現抑制、ASCL1遺伝子の発現抑制と、神経突起の伸長と分化誘導が認められた。このときは、BMI1遺伝子の発現抑制は認められなかった。NBの分化障害におけるNotch経路の関連を詳細に分析するため、Notch遺伝子の細胞内ドメイン(NICD)を強制発現させ、Notch経路を恒常的に活性化させたNBクローンの作成を試みた。NICDをクローニングし、レンチウイルスベクターに導入した。また、レンチウイルス発現システムによるNB細胞株へのNICD強制発現株を作成した。NICD強制発現NB細胞株を用いて、細胞増殖能、ATRAによる分化誘導効率、GSIによる分化誘導効率の観察を行った。さらに、BMI1shRNAをレンチウイルスベクターにクローニングすることに成功した。さらに、これを神経芽腫細胞株に発現させ、90%程度の遺伝子発現抑制効果を確認した。現在、これらの細胞株を用いて、細胞増殖能、ATRAによる分化誘導効率、GSIによる分化誘導効率の観察を行った。現在、以上の結果の再確認、B臨床検体を用いたBM1遺伝子、N0TCH関連遺伝子の発現解析を行い、NB細胞の分化障害におけるBMI1遺伝子の関与について考察を行なっている。この機序をさらに解明することにより、神経芽腫幹細飽が分化誘導されずに幹細胞特性を維持している機構を明らかにでき、今後新たな分化誘導療法に対するアプローチを与えることが可能になると期待される。

The existence, chemotherapy resistance, refractory, strong, stem cell therapeutic target, maintenance mechanism of stem cell characteristics, and resolution of differentiation barrier mechanism in neuroblastoma cells are urgent, and the high level of neuroblastoma cells, maintenance of stem cell characteristics of neuroblastoma cells, and activation of neuroblastoma cells are closely related. The purpose of this study is to explore the molecular targets of stem cell differentiation and differentiation. Analysis of the expression of EMI1 gene in NB cell line and high expression of BMI gene in M3 cell line NOTCH, ASCL1, HES1 and other related information are highly visible. NB cell lines KP-N-RTEM1, SH-SY 5Y cell lines, AIRA1μM differentiation induction, AIRA 2 hours after the start of treatment, ASCL1 hours, 6 hours after treatment, phox2b inhibition of the development of differentiation, neural processes to prolong the induction. The low level of BMI1 gene expression was observed in both groups. In the same cell line, Notch inhibitor (GSI) was used to inhibit HES1 gene expression, ASCL1 gene expression, and neuronal elongation and differentiation. The BMI1 gene expression is inhibited. The relationship between NB differentiation barrier and Notch pathway was analyzed in detail, and the stress development of Notch pathway and the constant activation of NB pathway were studied. NICD is a very important tool for the development of the Internet. The NICD stress strain of NB cell line was prepared. NICD stress induced NB cell line growth, ATRA induced differentiation, GSI induced differentiation. The BMI1 shRNA was successfully cloned into a cell phone. In addition, the inhibition effect of gene expression was confirmed to a 90% degree after the development of neuroblastoma cell lines. Now, the cell lines are used, cell proliferation, ATRA, differentiation induction, GSI, differentiation induction and observation. Now, reconfirmation of the above results, analysis of BM1 gene and N0TCH-related gene development in clinical samples, and investigation of BM1 gene in NB cell differentiation barriers. The mechanism of differentiation induction in the brain stem cells is discussed.

项目成果

A MYCN-amplified cell line derived from a long-term event-free survivor among our sixteen established neuroblastoma cell lines.

MYCN 扩增细胞系源自我们已建立的 16 种神经母细胞瘤细胞系中的长期无事件幸存者。

• DOI: 10.1016/j.canlet.2012.12.011
• 发表时间: 2013
• 期刊: Cancer Lett
• 影响因子: 9.7
• 作者: Sugimoto T;Gotoh T;Yagyu S;Kuroda H;Iehara T;Hosoi H;Ohta S;Ohira M;Nakagawara A.
• 通讯作者: Nakagawara A.

再発神経芽腫に対する治療戦略.当院における10年間の再発神経芽腫症例の検討

复发性神经母细胞瘤的治疗策略。我院10年来复发性神经母细胞瘤病例回顾。

• 发表时间: 2012
• 作者: 柳生茂希、家原知子;他
• 通讯作者: 他

Genomic Evolution in Relapsed Neuroblastoma

复发性神经母细胞瘤的基因组进化

• 发表时间: 2012
• 作者: Yagyu S;Iehara T;et al.
• 通讯作者: et al.