Investigation of the dynamic rearrangements of the pore structure of P2X2 receptor channel upon voltage dependent activation

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3個の2回膜貫通型サブユニットで構成されるATP 受容体チャネルP2X2は、膜電位依存性チャネルにみられる典型的な膜電位センサードメインが存在しないにも関わらず、膜電位依存的ゲーティングを示すことを、我々はこれまでに示してきた。本研究では、膜電位とATPに依存するP2X2の構造の変化を、点変異により導入したCys残基のCys修飾剤による修飾の速度の、状態による違いとしてとらえることを目的とした。そこで、ATP結合部位とチャネルポアを連結するリンカー部位に位置するAsp315とIle67に点変異によりCys残基を導入したコンストラクトをツメガエル卵母細胞に発現させた。そして、二本刺し膜電位固定法により、Cys残基に結合するCd2+ の投与によるチャネル電流の変化を記録し、その速度を、異なる状態間で比較解析した。ATP存在下、過分極状態と脱分極状態での速度を比較したところ、過分極状態の方が、優位に修飾が速かった。また、ATP非存在下と存在下での修飾速度を比較したところ、ATP非存在下では非常に遅く、ほとんど修飾が起らなかった。これらの結果から、リンカー部位において、膜電位とATP結合の有無に依存して構造の変化が起きることが明らかになった。さらに、膜電位依存性のゲーティングを示さないチャネルポアの変異体Thr339Serを対象に、同様な実験を行ったところ、Cys変異体のCd2+ による修飾速度は、過分極と脱分極で差を示さなかった。この結果から、捉えた、膜電位に依存する構造変化が、膜電位依存的なポアのゲーティングに伴うものであることが結論された。以上の結果から、P2X2受容体チャネルのATP結合部位と膜貫通部位をつなぐリンカー部位において、ATP結合のシグナルと膜電位変化のシグナルの両方が構造変化を引き起こすことが示された。