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生きた細胞内のRNAの可視化と光制御法の開発

活细胞中RNA的可视化和光学控制方法的开发

基本信息

批准号：
08J02567
负责人：
服部満
金额：
$ 1.54万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本申請研究では,生きた細胞内においてRNA分子と特異的に結合し,外部から光照射によって制御することを可能にする新規な機能性分子プローブを開発する.RNA認識プローブは,RNA結合ドメインPUM1HD分子を基本とし,光制御プローブはPUM1HDと光受容体として青色光受容体フォトトロピン内のLOV2ドメインを用いる.LOV2ドメインは460nm付近の波長の光(hv)を照射すると構造変化を起こすことが明らかとなっている.これを利用してPUMIのRNA結合をLOV2ドメインの構造変化で制御するプローブを開発する.対象となるmRNA配列からの翻訳を抑制する方法として,リボザイム配列を利用した翻訳抑制システムの構築を試みた.用いるリボザイム配列としてはHammerhead ribozyme(HHR)グループの配列を選択した.HHR配列は自己触媒活性を有し自身内のRNA配列を切断するため,この現象を利用して任意のmRNA配列からの翻訳を抑制するシステムを開発した.このリボザイム制御をコントロールするために,RNA結合ドメインPUM1HDを利用した.まず,リボザイムRNA配列の中に,PUM1HDが特異的に結合する配列を配置してその影響を確認した.RNA二次構造予測ソフトを元に,二本鎖構造,相補配列を加えてアレンジした結果,配置前と同レベルの翻訳抑制能を持つリボザイム構造を構築することに成功した.実際にこの配列と改良型PUM1HDを培養細胞へ共発現させた結果,翻訳抑制が一部解除されて発光値が上昇した.この結果は,リボザイム構造にPUM1HDが結合した結果,リボザイム酵素活性を阻害しRNAが翻訳ステップへ進行したことを示している.これはHHRリボザイムの活性をRNA結合タンパク質によってコントロールすることに成功した初めての例である.

The purpose of this application is to study the combination of intracellular RNA molecular characteristics, external exposure to light, and the possibility that new regulation functional molecules may be activated. RNA is coupled with the basic PUM1HD molecular assay. The light system is sensitive to PUM1HD light, the light capacitor is blue, and the internal LOV2 light is sensitive. LOV2 near wavelength phosphor (hv) is used to irradiate the light source. In this paper, we use the combination of PUMI RNA and LOV2 system to create a system to control the operation of the train. For example, if you want to use mRNA to suppress the method, and to use the flip to suppress the test. You can choose your own catalyst activity by using your own catalyst activity. You can use your own RNA to cut off your own activity, and you can use your own mRNA to prevent you from opening your computer. This is the best way to make sure that you have a lot of trouble, and that you can make use of the information by combining RNA with PUM1HD. In the middle of the RNA configuration, the combination of the PUM1HD special configuration will make sure that the RNA has been created twice to make sure that it has been built by an ordinary university, and that it will be matched with the results of each other. Before the configuration, you will be able to maintain your success in the same way as you can. In this paper, the improved PUM1HD cell culture system is used to compare the results, and to check the results of the first part of the experiment. The results showed that the results of the PUM1HD test were combined with the results of the test, and the enzyme activity was used to block the RNA. The results showed that the enzyme activity blocked the activity of the enzyme. This is a good example of the success of a successful HHR. This is the first example of an active RNA.