Ras類縁分子Rap2の独自細胞機能に関するプロテオミクス的解析

Ras 相关分子 Rap2 独特细胞功能的蛋白质组学分析

• 批准号: 08J04908
• 负责人: 山城 義人
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: University of the Ryukyus
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J04908/
• 关键词: プロテオミクス的解析

所属研究室で癌遺伝子産物Rasの類縁分子Rap2がMAP4K (TNIK、MINK等)を介して細胞の形態、接着、極性、運動等を制御することが見いだされたが、これらの現象はJNK非依存的であった。本研究では、Rap2-MAP4K複合体によるJNK非依存性表現型の解析とRap2-MAP4K複合体により発現量やリン酸化状態が変化する蛋白質やRap2-MAP4K複合体に結合する蛋白質をプロテオミクス的手法で解析している。解析材料として、マウスに移植して扁平上皮癌を形成しても殆ど転移しない低転移性株と、この親株から樹立したRap2を発現しない高転移性株のペアを選び、ディファレンシャル二次元電気泳動(2D-DIGE)とMALDI-TOF/MSによるPMF法とMS/MS法で両細胞株の蛋白質発現プロファイルを比較した。その結果、本来は腺上皮など単層上皮で発現するサイトケラチン8および18が後者で異所性に発現していた。ウエスタン解析やRT-PCRでも同様の結果が得られ、免疫染色でも後者にのみ両ケラチンにより形成されたフィラメントを認めた。Rap2を発現しない高転移性株はin vitroで親株に比べ高い運動能・基底膜浸潤能を示したが、親株に両ケラチンを発現させると、運動能の促進と基底膜浸潤能の促進が見られた。さらに、附属病院の皮膚扁平上皮癌症例を対象に両ケラチンの免疫組織染色解析を行ったところ、形質転換したケラチノサイトが表皮基底膜を越えて浸潤した症例で陽性例の頻度が統計学的に有意に高く、両ケラチンの異所性発現が皮膚扁平上皮癌の浸潤に関与すると結論づけて報告した。

在实验室中，发现RAP2是癌基因产品的相关分子，RAS，调节细胞形态，粘附，极性，运动等。在这项研究中，我们使用RAP2-MAP4K复合物分析了与JNK独立的表型，并分析了蛋白质，其表达水平和磷酸化状态由于Rap2-MAP4K复合物而导致的蛋白质和蛋白质与RAP2-MAP4K复合物结合，并使用蛋白质组学结合了蛋白质。作为分析材料，我们选择了一对低度转移性菌株，即使将小鼠植入以形成鳞状细胞癌和不表达从该母体菌株中确定的RAP2的高度转移性菌株，并使用两种细胞的蛋白质表达曲线，使用差异性两维电动机（2D-dige和pmf）进行比较。结果，最初在单层上皮（例如腺上皮）中表达的细胞角蛋白8和18在后者中以异位表达。通过西方分析和RT-PCR获得了相似的结果，并且免疫染色显示了两角蛋白仅在后者中形成的细丝。与母体菌株相比，不表达RAP2的高度转移性菌株表现出更高的运动性和基底膜侵袭能力，但是当两个角蛋白在父菌株中表达时，它们显示出促进运动性和基底膜侵袭能力的促进。 Furthermore, when immunohistochemical analysis of both keratin was conducted in patients with squamous cell carcinoma of the affiliated hospital, the frequency of positive cases in cases in which transformed keratinocytes infiltrated beyond the epidermal basement membrane was statistically significantly higher, and ectopic expression of both keratin was involved in the invasion of squamous cell carcinoma of the skin, and the report得出的结论是，两种角蛋白的异位表达都参与了皮肤鳞状细胞癌的侵袭。