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発癌に関わるmicro-RNAの標的タンパク質の同定と癌化における分子機構の解明

鉴定癌变相关的micro-RNA靶蛋白并阐明癌变的分子机制

基本信息

批准号：
08J09072
负责人：
神崎浩孝
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者はマイクロRNA(miRNA)が癌に及ぼす影響の作用機序の解明と癌の分子標的治療薬の開発を目的とし、2次元電気泳動と質量分析計を用いたプロテオーム解析によるmiRNAの直接的な標的タンパク質の同定を行ってきた。標的miRNAそれぞれに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド(Greiner bio-one社)をし、miRNA miRNAを高発現している癌細胞株(SBC-3,MCF-7)に導入することによりタンパクの量的変動を確認した。IPG Dry Strip, pH3-10NL(BIO-RAD社)を用いて2次元電気泳動し、蛍光試薬(BIO-RAD社,GEヘルスケア社)によって染色後、ゲルイメージ像を解析用コンピューターとPDQuest ver. 8.0.1(BIO-RAD社)を用いて比較解析した。発現が1.5倍上昇していたものはスポットについて切り出しを行い、トリプシンによるゲル内消化後、HPLC-Chip/MS System(Agillent社)によってタンパク質を同定し、239種類のmiRNA標的候補タンパク質をえた。これら標的候補タンパク質に対し、mRNAの3'UTR領域をデータベース解析し、miRNA標的配列を探索することで、標的候補タンパク質の中から、miRNA標的配列を持つものを14種類同定するに至った。これら候補タンパク質については、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にこれら遺伝子のmiRNAの標的塩基配列を組み込んだプラスミドを作成し、ルシフェラーゼアッセイを行うことによって、miRNAによる標的遺伝子の発現抑制作用と、anti-miRNA locked nucleic acid(LNA)(Greiner社)によるmiRNA抑制(ルシフェラーゼ活性の回復)作用を確認し、いずれも良好な結果がえられた。引き続き、ウエスタンブロット解析によるタンパク質の変動を確認し、リアルタイムPCRによって標的遺伝子のmRNAは変動しないことを確認した。これらの検証実験から、14種類の候補タンパク質のうち、RAB14,IMPDH1, NPEPL1の3種類をmiRNAの直接的な標的として同定した。いずれも新規の標的遺伝子/タンパク質であった。

The applicant is interested in identifying the molecular targets of cancer and their mechanisms of action for the development of therapeutic agents for the treatment of cancer by using two-dimensional electrokinetic and mass spectrometry to identify the direct targets of miRNA. The target miRNA was introduced into cancer cell lines (SBC-3,MCF-7) with high miRNA expression and confirmed to be a complement to the target miRNA (Greiner bio-one). IPG Dry Strip, pH3-10NL(BIO-RAD), 2D Electrophoresis, Light Test (BIO-RAD,GE), Dyeing and Image Analysis. 8.0.1(BIO-RAD) is used for comparative analysis. After internal digestion, HPLC-Chip/MS System(Agillent Corporation) identified 239 miRNA target candidates with the same quality. The target candidate is selected from the group consisting of 14 types of target candidates. The target candidate is selected from the group consisting of 14 types of target candidates. Anti-miRNA locked nucleic acid(LNA) is an anti-miRNA locked nucleic acid(LNA) that inhibits the expression of target miRNA.(Greiner) miRNA inhibition (recovery of activity) was confirmed, and good results were obtained. The mRNA expression of the target gene was confirmed by PCR. 14 types of candidate miRNA, RAB14,IMPDH1, NPEPL1, and 3 types of direct miRNA targets. The new rules are based on the following: