発癌に関わるmicro-RNAの標的タンパク質の同定と癌化における分子機構の解明

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申請者はマイクロRNA(miRNA)が癌に及ぼす影響の作用機序の解明と癌の分子標的治療薬の開発を目的とし、2次元電気泳動と質量分析計を用いたプロテオーム解析によるmiRNAの直接的な標的タンパク質の同定を行ってきた。標的miRNAそれぞれに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド(Greiner bio-one社)をし、miRNA miRNAを高発現している癌細胞株(SBC-3,MCF-7)に導入することによりタンパクの量的変動を確認した。IPG Dry Strip, pH3-10NL(BIO-RAD社)を用いて2次元電気泳動し、蛍光試薬(BIO-RAD社,GEヘルスケア社)によって染色後、ゲルイメージ像を解析用コンピューターとPDQuest ver. 8.0.1(BIO-RAD社)を用いて比較解析した。発現が1.5倍上昇していたものはスポットについて切り出しを行い、トリプシンによるゲル内消化後、HPLC-Chip/MS System(Agillent社)によってタンパク質を同定し、239種類のmiRNA標的候補タンパク質をえた。これら標的候補タンパク質に対し、mRNAの3'UTR領域をデータベース解析し、miRNA標的配列を探索することで、標的候補タンパク質の中から、miRNA標的配列を持つものを14種類同定するに至った。これら候補タンパク質については、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にこれら遺伝子のmiRNAの標的塩基配列を組み込んだプラスミドを作成し、ルシフェラーゼアッセイを行うことによって、miRNAによる標的遺伝子の発現抑制作用と、anti-miRNA locked nucleic acid(LNA)(Greiner社)によるmiRNA抑制(ルシフェラーゼ活性の回復)作用を確認し、いずれも良好な結果がえられた。引き続き、ウエスタンブロット解析によるタンパク質の変動を確認し、リアルタイムPCRによって標的遺伝子のmRNAは変動しないことを確認した。これらの検証実験から、14種類の候補タンパク質のうち、RAB14,IMPDH1, NPEPL1の3種類をmiRNAの直接的な標的として同定した。いずれも新規の標的遺伝子/タンパク質であった。