シロイヌナズナにおけるDRBファミリー2本鎖RNA結合タンパク質の相互作用因子の

拟南芥中 DRB 家族双链 RNA 结合蛋白的相互作用物

• 批准号: 08J09276
• 负责人: 中澤 悠宏
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J09276/
• 关键词: シロイヌナズナ; RNAサイレンシンダ; 2本鎖RNA結合タンパク質; タンパク質間相互作用

これまでにシロイヌナズナのDCLファミリータンパク質(DCL1~DCL4)とDRBファミリー2本鎖RNA結合タンパク質(DRB1~DRB5)の間に相互作用活性を見出してきた。また、DCL4とDRB4が生体内で複合体を形成し、RNAサイレンシング(ta-siRNA経路)で機能することを明らかにした。DCL4とDRB4の相互作用について詳細に解析した結果、生体内でDRB4との相互作用に関与するDCL4のモチーフがC末端(RNaseIII,dsRBM)に存在することが示唆された。また、DRB4のdsRBMを含むN末端領域だけではDCL4と相互作用することができず、DCL4との相互作用にはDRB4のC末端領域が必要である可能性やDRB4の立体構造が重要である可能性が示唆された。Yeast two-hybrid法を利用して、DRBタンパク質やDCLタンパク質と相互作用するタンパク質を探索するために、two-hybrid用コンストラクトを作成した。新規相互作用タンパク質のスクリーニングの準備を進めている。また、免疫沈降を用いてDCL4-DRB4複合体を精製し、複合体に含まれる新規タンパク質の同定を進めている。RNAサイレンシングがウイルス防御機構として機能することから、DRBタンパク質が生体内でウイルスRNAに作用しているか検証を行うために、カブモザイクウイルス(TuMV-CFP,TuMV-GFP)の植物体(シロイヌナズナ、タバコ)への感染実験系の確立を行った。CFP蛍光、GFP蛍光、ELAISA法でウイルスの感染確認を行っている。過剰発現株や変異株のウイルス抵抗性の評価や免疫沈降法によってDRBタンパク質を精製しウイルスRNAとの相互作用の有無を検証している。

The interaction activity between DCL and DRB binding proteins (DCL1 ~ DCL4) and DRB binding proteins (DRB1~DRB5) was observed. DCL4 and DRB4 have been shown to function as a complex in vivo, and as an RNA vector (ta-siRNA). The interaction between DCL4 and DRB4 was analyzed in detail. The results showed that the interaction between DCL4 and DRB4 in vivo was related to the existence of C-terminal (RNase III,dsRBM). The possibility that DRB4 dsRBM contains an N-terminal domain for interaction with DCL4 and that DRB4 C-terminal domain is necessary for interaction with DCL4 is demonstrated. Yeast two-hybrid method is used to explore the nature of DRB and DCL and to create two-hybrid methods. New rules for interaction, quality and preparation DCL4-DRB4 complex purification, complex purification, new purification and quality identification The establishment of an infection system in plants (TuMV-CFP,TuMV-GFP) that function as a defense mechanism for RNA and DRB in vivo. CFP light, GFP light, ELAISA method to confirm the infection of the virus Evaluation of DRB resistance of over-developed strains and mutants and identification of DRB RNA interactions by immunosedimentation

项目成果

シロイヌナズナDICER-LIKE4と2本鎖RNA結合タンパク質DRB4の相互作用解析

拟南芥DICER-LIKE4与双链RNA结合蛋白DRB4的相互作用分析

• 发表时间: 2008
• 作者: Tadahiro Oyama;et al.;中澤悠宏
• 通讯作者: 中澤悠宏