初代肝培養細胞を用いた、HCV感染時におけるアポトーシスの解析

昨年度、我々はヒト初代肝培養細胞(HuS-E/2 cell)におけるHCV複製効率は非常に低い事を明らかにした。本年度は、より複製効率をあげるため、より生体に近い感染実験系を構築し、HuS-E/2細胞を用いた3次元培養を試みた。今回我々は、Thermoreversible gelation polymer gel(TGP gel)を用いHuS-E/2 cellを3次元培養下でpre-cultureした後、HCVを感染させ、細胞内HCV RNAについてreal-time PCR法で解析したところ、感染後HCV RNA量は経時的に減少した。しかし、数日後からHCV RNA量の増加が認められた。また、HCV RNA量においては2次元培養した時と比べ、有意に複製が増加している事が明らかとなった。次に、この感染効率の上昇は何に起因しているのかを明らかにする事を試みた。現在、HCVのentryに必要な分子は主として、tetraspanin CD81,scavenger receptor B-1(CE-B1)及びタイトジャンクション分子であるClaudin1およびoccludin等が報告されている。今回我々は、2次元培養時、および3次元培養時におけるCD81, Claudin1, Occludinの細胞内局在について検討したところ、HuS-E/2細胞の3次元培養時においてClaudinは細胞膜上に局在するのに対し、2次元培養時においては細胞質および核内に局在している事が明らかとなった。CD81およびOccludinにおいては2次元および3次元培養時共に細胞膜上に局在している事が明らかとなった。今後、3次元培養感染系を用いて、caspase-3等のアポトーシスマーカーについて解析し、HCV感染による細胞増殖抑制がアポトーシスによるものかを明らかにしようと考えている。

昨年度、我々はヒト初代肝培養細胞(HuS-E/2 cell)におけるHCV複製効率は非常に低い事を明らかにした。本年度は、より複製効率をあげるため、より生体に近い感染実験系を構築し、HuS-E/2細胞を用いた3次元培養を試みた。今回我々は、Thermoreversible gelation polymer gel(TGP gel)を用いHuS-E/2 cellを3次元培養下でpre-cultureした後、HCVを感染させ、細胞内HCV RNAについてreal-time PCR法で解析したところ、感染後HCV RNA量は経時的に減少した。しかし、数日後からHCV RNA量の増加が認められた。また、HCV RNA量においては2次元培養した時と比べ、有意に複製が増加している事が明らかとなった。次に、この感染効率の上昇は何に起因しているのかを明らかにする事を試みた。現在、HCVのentryに必要な分子は主として、tetraspanin CD81,scavenger receptor B-1(CE-B1)及びタイトジャンクション分子であるClaudin1およびoccludin等が報告されている。今回我々は、2次元培養時、および3次元培養時におけるCD81, Claudin1, Occludinの細胞内局在について検討したところ、HuS-E/2細胞の3次元培養時においてClaudinは細胞膜上に局在するのに対し、2次元培養時においては細胞質および核内に局在している事が明らかとなった。CD81およびOccludinにおいては2次元および3次元培養時共に細胞膜上に局在している事が明らかとなった。今後、3次元培養感染系を用いて、caspase-3等のアポトーシスマーカーについて解析し、HCV感染による細胞増殖抑制がアポトーシスによるものかを明らかにしようと考えている。