光によるリアルタイム蛋白質不活化法を用いた神経-グリア相互作用新規解析法の開発

开发一种利用光实时蛋白质失活来分析神经元-胶质细胞相互作用的新方法

• 批准号: 20659039
• 负责人: 櫻井 隆
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659039/
• 关键词: 神経科学; プロテオーム; 組換え抗体

神経細胞とグリア細胞は近接・接着部位に受容体、チャネル、トランスポーターなどの膜機能分子を集積し、相互に情報伝達や機能調節を行っている。その機能は多岐にわたり複雑な細胞形態・組織構築を背景にしているため、関連分子の探索・解析のためには相互作用している場において直接機能解析を行う新しいアプローチが必要とされている。我々が開発した蛍光色素標識抗体と光照射により特定の蛋白質を生細胞において不活性化するFluorophore-assisted light inactivation(FALI)は、このような解析に有用な研究方法と考えられる。本研究は、抗体ライブラリーを用いたFALIにより機能変化を起こす抗体クローンを選択することで新規の機能分子を探索する手法を神経・グリア細胞の膜ラフト集積蛋白質に応用するための基盤技術開発を目的としている。本年度は、1) 昨年度準備したボスホパンテテイニルトランスフェラーゼによる抗体のポストラベルの標識条件・効率を検討した。蛍光色素標識のためには高濃度の基質を必要とし効率的にも劣ることが明らかとなったため、組換え抗体のin vitro翻訳時にフルオレセインを導入する方法を検討中である。これまで実績のあるβガラクトシダーゼを標的とした実験を進めている。2) 抗体を介さずに細胞表面発現膜蛋白質に直接蛍光色素を導入して細胞を用いたFALIのコントロール実験を行うために、株化細胞、初代培養神経細胞における蛍光標識を行った。トランスフェクションにより培養細胞にSNAP, CLIPなどのポストラベル用タグを融合させた膜蛋白質を発現させ、細胞表面における蛍光標識の条件を検討した。モデル系を用いて標的蛋白質の不活性化を確認し、探索に適用するための条件設定を行う。

The cells are close to each other, and the receptor, the receptor. The function of the cell is complex, the morphology of the cell is organized, the background is complex, the exploration of the related molecules is complex, the interaction is complex, the direct function is complex, and the new function is complex. We have developed Fluorophore-assisted light inactivation(FALI) for specific protein production cells under light irradiation, and useful research methods for the analysis of these proteins. The aim of this study is to explore new functional molecules for antibody selection and application in cell membrane aggregation. This year, 1) yesterday's preparations for the identification of antibodies and their identification conditions and effectiveness were discussed. The method of introducing the fluorescent pigment into the substrate at high concentration is discussed. This is the first time I've ever seen a woman who's been in the business. 2)Antibody mediates cell surface development of membrane proteins, direct introduction of fluorescent pigments into cells, cell culture, and primary culture of neurons. To investigate the conditions for SNAP, CLIP, fusion, membrane protein development, and cell surface labeling in cultured cells. To confirm the inactivation of target proteins and explore the conditions for application.