光によるリアルタイム蛋白質不活化法を用いた神経-グリア相互作用新規解析法の開発

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神経細胞とグリア細胞は近接・接着部位に受容体、チャネル、トランスポーターなどの膜機能分子を集積し、相互に情報伝達や機能調節を行っている。その機能は多岐にわたり複雑な細胞形態・組織構築を背景にしているため、関連分子の探索・解析のためには相互作用している場において直接機能解析を行う新しいアプローチが必要とされている。我々が開発した蛍光色素標識抗体と光照射により特定の蛋白質を生細胞において不活性化するFluorophore-assisted light inactivation(FALI)は、このような解析に有用な研究方法と考えられる。本研究は、抗体ライブラリーを用いたFALIにより機能変化を起こす抗体クローンを選択することで新規の機能分子を探索する手法を神経・グリア細胞の膜ラフト集積蛋白質に応用するための基盤技術開発を目的としている。本年度は、1) 昨年度準備したボスホパンテテイニルトランスフェラーゼによる抗体のポストラベルの標識条件・効率を検討した。蛍光色素標識のためには高濃度の基質を必要とし効率的にも劣ることが明らかとなったため、組換え抗体のin vitro翻訳時にフルオレセインを導入する方法を検討中である。これまで実績のあるβガラクトシダーゼを標的とした実験を進めている。2) 抗体を介さずに細胞表面発現膜蛋白質に直接蛍光色素を導入して細胞を用いたFALIのコントロール実験を行うために、株化細胞、初代培養神経細胞における蛍光標識を行った。トランスフェクションにより培養細胞にSNAP, CLIPなどのポストラベル用タグを融合させた膜蛋白質を発現させ、細胞表面における蛍光標識の条件を検討した。モデル系を用いて標的蛋白質の不活性化を確認し、探索に適用するための条件設定を行う。