機能プロテオミクスのためのプロテインチップの開発

功能蛋白质组学蛋白质芯片的开发

基本信息

批准号：
20659091
负责人：
藏滿保宏
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659091/
关键词：
機能プロテオミクスプロテインチップ蛋白質間相互作用

项目摘要

タンパク質間相互作用解析用チップ作製のために、モデル蛋白質としてHSP70.1を用いてプロトタイプの作製を目標とした。HSP70.1蛋白質にGFP、ヒスチジン-tag(His-tag)、システイン-tag(Cys-tag)を融合させたHis-GFP-HSP70.1-Cys融合蛋白質を作製し、His-tagと結合するHis-Select Nickel Affinity Gel(Niビーズ)により精製したものをCys-tagと結合するマレイミド基板に固定化させたチップを作製した。また、HSP70.1の発現量を視覚的にモニターするために緑色蛍光蛋白質GFPもHSP70.1とともに融合タンパク質として融合させた。作製したHSP70.1-GFP搭載チップを蛍光顕微鏡(KEYENCE)とDNAアレイチップリーダー(PerkinElmer)を用いてスキャンし固定化の状態を確認したところ、概ね良好であったが、所々非特異的なシグナルを感知したため、washing過程の検討を繰り返した。その結果、2MEでブロッキングすることでかなりの非特異的なシグナルを排除することが可能となった。続いて搭載したHSP70.1が蛋白質として抗体に認識されるか否かを抗HSP70抗体を用いて確認したところ、抗体が結合して安定したシグナルを確認することができたため、次に肝細胞癌細胞株Huh7からNP40を含むlysis bufferを用いて抽出した細胞内可溶性蛋白抽出液を反応させた後にwashingを行なってから、HSP70.1に結合する蛋白質を含む溶液を抽出した。抽出液を質量分析計で解析したが、HSP70.1に結合する蛋白質の同定まではできなかった。本研究で開発した蛋白質間相互作用解析用チップは搭載された蛋白質がしっかりと抗体に認識され、非特異的シグナルも検出されないことから、蛋白-蛋白相互作用を初めとする機能プロテオミクス研究に有効であることが期待できる。

为了制备用于蛋白质蛋白质相互作用分析的芯片，目标是使用HSP70.1作为模型蛋白制备原型。 A His-GFP-HSP70.1-Cys fusion protein was prepared by fusion of GFP, histidine-tag (His-tag), and cysteine-tag (Cys-tag), and a chip was purified by His-Select Nickel Affinity Gel (Ni beads) that binds to His-tag, and immobilized on a maleimide substrate that binds to Cys-tag.此外，还将绿色荧光蛋白GFP与HSP70.1一起融合为融合蛋白，以视觉监测HSP70.1的表达水平。使用荧光显微镜（键）和DNA阵列读取器（Perkinelmer）扫描制备的HSP70.1-GFP固定芯片，以确认固定状态。尽管通常很好，但在某些地方检测到了非特异性信号，但重复洗涤过程。结果，用2ME阻止可以消除明显的非特异性信号。接下来，使用抗HSP70抗体来确认是否通过抗体识别加载的Hsp70.1是蛋白质，并确认了抗体结合和稳定信号。然后，从肝细胞癌细胞系HUH7中反应使用含有NP40的裂解缓冲液提取的细胞内可溶性蛋白提取物，然后洗涤，然后清洗，然后提取含有与HSP70.1结合的蛋白质结合的溶液。使用质谱仪分析提取物，但无法鉴定与HSP70.1结合的蛋白质。在本研究中开发的蛋白质 - 蛋白质相互作用分析的芯片清楚地通过抗体清楚地识别，并且未检测到非特异性信号，因此可以预期它在功能蛋白质组学研究中有效，包括蛋白质蛋白质相互作用。