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実験用魚類の遺伝子破壊低コスト化のための変異濃縮技術の開発

开发突变富集技术以降低实验鱼基因破坏的成本

基本信息

批准号：
21650098
负责人：
谷口善仁
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Keio University (2010)Kyoto University (2009)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

TILLING法による遺伝子変異個体の作製は、数千個体よりなるランダムミュータジェネシスした変異ライブラリーから、目的の遺伝子に変異が導入されている個体を選別するという手順を経る。小型脊椎動物で手軽に扱えるモデル動物として注目を集めているメダカやゼブラフィッシュでは、すでにこの手法により数百種類の遺伝子破壊体が作られている。現在は、数千個体すべてについて目的遺伝子を直接塩基配列決定ないし温度融解曲線を使用する方法で変異探索を行っているが、変異の頻度が低いために効率が極めて悪い。そのために、変異をキャプチャーできるMuトランスポゾンをビオチンタギングし、変異を濃縮する方法を試みた。Muトランスポザーゼが結合するDNA断片を合成し、その末端にビオチンを結合させた。不要部位を後に切断除去するために制限酵素部位を導入した変異型DNAは、大腸菌で発現させたMuトランスポザーゼと結合し、タンパク-DNA複合体を形成した。すでにTILLING法で作製し報告済みのp53変異体と野生型のメダカよりそれぞれ変異部位を含むDNA断片をPCR増幅し、熱変性、アニールによりヘテロデュプレクスを形成させてMuトランスポザーゼ-DNA複合体を反応させたところ、転移反応が観察された。DNAを回収し、塩基配列を決定したところ、目的の部位以外にも転移するなど、感度、特異性ともに十分満足のいく結果が得られなかった。そのため、Muトランスポザーゼによる転移反応から、ビオチン化したオリゴヌクレオチドをT4リガーゼによりアダプターライゲーションする方法に変更した。Muで確立した手法によりp53ヘテロデュプレクスからDNA断片を回収して塩基配列を決定したところ、変異を含む断片が効果的に沈降されていることが確認された。現在イルミナGAIIxを用いた大規模シーケンスにより、変異部位の単離同定を進めているところである。

In the TILLING method, there are many thousands of children, thousands of children, and many thousands of children. The goal is to enter the system. Small-sized chiropractic animals pay close attention to the collection and operation of small vertebrae, and hundreds of other types of animals are broken into bodies. At present, thousands of people are required to determine the temperature melting curve directly. Use this method to explore the accuracy of the temperature melting curve. Please do not know what to do. Please do not know what to do. Do not know what to do. Please do not know what to do. Please do not know what to do. The Mu fragments were combined with the DNA fragments, and the ends of the fragments were combined with each other. Do not cut off at the back of the body to remove the enzyme restriction enzyme in the tail, and the part of the restriction enzyme is inserted into the DNA, and the complex of Mu and DNA is formed by the combination of the enzyme and the enzyme. The TILLING method is used to report that there is a DNA fragment in the body of the wild type, which is the size of the PCR, the sex, the nature, the formation of the Mu, the Mu, the DNA complex, the wild type and the wild type. The DNA response, the base configuration, the determination of the sensitivity, the sensitivity, the sensitivity, This is the first step in the process. The Mu is used to change the method, and to change it. Mu makes sure that the manipulation is correct, and that the DNA fragments are returned to each other in order to determine the contents of the fragments and the sinking that contains the results of the fragments. Now you can use a large-scale model to make sure that the location and location of the GAIIx is the same as that of the system.