細胞内外のストレスに応答するKeap1-Nrf2システムの多様な感知機構

Keap1-Nrf2系统响应细胞内和细胞外应激的多种传感机制

基本信息

批准号：
09J00858
负责人：
李麗
金额：
$ 0.9万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J00858/
关键词：
Keap1 Nrf2 小胞体ストレス PERK ATF4 過酸化水素トランスジェニックGFPフィッシュ

项目摘要

本研究の目的は,Keap1-Nrf2システムのストレス応答機構のセンサー分子の同定と具体的な分子基盤を解明する。22年度では主に小胞体ストレスセンサーの同定を行た。これまでの研究では,小胞体ストレスによるNrf2の活性化はPERKが関わることが示唆した。今年度は,このポイントを捕まて,研究を展開した。まず最初はPERKを単離した。初期胚の解析系を利用し,Keap1とNrf2と共発現した。しかしPERKの存在下でもNrf2の活性化が観察されなかた。PERKの下流因子ATF4に注目。ATF4も単離した。同じくKeap1とNrf2と初期胚に共発現した。その結果Nrf2の活性は見れた。Keap1-Nrf2システムは小胞体ストレスへの応答にはATF4が重要であることが示唆した。また,5日胚を用いる,knock down解析をした。5日胚は小胞体ストレス誘導剤に反応できなくなたことを検出した。初期胚免疫染色解析の結果からATF4はNrf2タンパク質の安定性に関わることを証明した。ATF4のNrf2を活性化する機構をさらに理解するため,ATF4の分子解析を行た。DNA結合ドメインやヘテロダイマー形成ドメインに点変異を導入した。初期胚の解析系にKeap1とNrf2と共発現し,Nrf2の活性化が検討した。両方とも野生型ATF4よりNrf2の活性化が減少した。その結果から,b-ZipドメインはNrf2の活性化に重要であることを示唆した。以上の結果から,小胞体ストレスによる,PERK系路が活性化し,その下流のeIF2aがりん酸化する(eIF2aりん酸化抗体を用いた免疫プロト検討の結果により),ATF4が翻訳され,そのことによりNrf2を活性化する。これまでの小胞体ストレスセンサーに関する研究では培養細胞を利用したものが多く,PERKがNrf2を直接にりん酸化することと考えられているが,今回の研究からPERKではなくその下流にあるATF4はNrf2を活性化する重要な因子と証明した。

这项研究的目的是鉴定传感器分子并阐明KEAP1-NRF2系统应力响应机制的特定分子基础。在2010财年，我们主要确定内质网应力传感器。先前的研究表明，PERK参与内质网应激的NRF2激活。今年，我们抓住了这一点并进行了研究。首先，PERK是孤立的。使用早期胚胎的分析系统，它与KEAP1和NRF2共表达。但是，即使在存在PERK的情况下，也没有观察到NRF2的激活。专注于ATF4，这是PERK的下游因素。 ATF4也被隔离。它也与KEAP1和NRF2的早期胚胎共表达。结果，观察到NRF2活性。 KEAP1-NRF2系统表明，ATF4对于响应内质网应激很重要。此外，使用5天的胚胎进行敲低分析。 5日，发现胚胎无法对内质网应激诱导剂做出反应。早期的胚胎免疫染色分析表明，ATF4参与NRF2蛋白的稳定性。为了进一步了解在ATF4中激活NRF2的机制，进行了对ATF4的分子分析。点突变被引入DNA结合和异二聚体形成域中。它与早期胚胎分析系统中的KEAP1和NRF2共表达，并研究了NRF2的激活。两者均表现出与野生型ATF4相比，NRF2的激活降低。结果表明，B-ZIP结构域对于NRF2激活很重要。从上述结果中，惠尔氏质网应激被激活，而PERK系统下游的EIF2A被磷酸化（根据使用EIF2A磷酸化抗体的免疫蛋白酶研究的结果），从而导致ATF4的翻译，从而激活NRF2。在许多先前关于内质网应力传感器的研究中，据信PERK直接磷酸化NRF2，但是这项研究证明，下游的ATF4是激活NRF2的重要因素。