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B型肝炎ウイルスによる多核化誘発機構の解明

乙型肝炎病毒诱导多核机制的阐明

基本信息

批准号：
09J00941
负责人：
杉山真也
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は前年度までに樹立を行った3次元での肝細胞培養システムでのアッセイを実施した。複数の細胞株から選定を行い、KIM-1株が最も感染効率が良好であった。HBVの各構成遺伝子を個別に遺伝子導入することでこの多核化出現の原因遺伝子を検討した。各遺伝子の発現の後に、フローサイトメーターで核数の検討を行ったところ、HBX遺伝子を発現するもので多核化が誘導されていた。続いて、HBX遺伝子の野生型、1762T/64A変異型、1653T変異型、1653T & 1762T/64A変異型を作成し、HuH7細胞にトランスフェクションすることでcDNAマイクロアレイ解析を実施した。その結果、1762T/64A変異型では他と比較した場合に、DNA polymerase alpha (POLA)が有意に減少していることを見出した。POLAとChk1のS345リン酸化には密接な関連にあるため、HBXの各変異体に関して、Chk1のS345のリン酸化の程度とPOLAの発現レベルについてリアルタイムPCRとイムノブロットで解析を行なっているところである。並行してHBX遺伝子のトランスジェニックマウス(TGマウス)の作出を実施した。HuH7細胞に使用したものと同じ変異型を利用し、C57BL/6マウスにそれぞれの遺伝子を組み込んだ。PCRとサザンブロットによりトランスジーンの有無を確認し、それぞれのトランスジーンを保有数するHBX-TGマウスを繁殖することができた。現在、各系統でトランスジーンのホモ化作業を進めている。当初の計画通り、TGマウスの作成と繁殖に成功した。また、in vitroでのマイクロアレイ解析によりChk1と直接的な関連を持つPOLA遺伝子を同定した。細胞株レベルでHBXとChk1、POLAの関係性を解析すると共に、TGマウスを利用して個体レベルで、HBXがもつ肝細胞の多核化機構について検討を進める。

In the current year, までに in the previous year, を was established, った three-dimensional で <s:1> hepatocyte culture was carried out, システムでアッセアッセを and を were performed, and た was carried out. The multiple <s:1> cell lines らら selected を line ら and KIM-1 line が had the most good が infection efficacy であった. Each constitutional heritage HBV の伝 child を individual に but 伝 import することでこの nucleation の cause more heritage 伝 son を beg し検た. After each legacy 伝 son の発 is のに, フローサイトメーターで auditing の検 line for をったところ, HBX but 伝を発 now するもので more nucleation induced さがれていた. 続いて, traces of HBX 伝の wild type, 1762 t/t - 64 - a special shape, 1653, 1653 t and 1762 t / 64 a - shaped をし consummate, HuH7 cells にトランスフェクションすることで cDNA マイクロアレイ parsing を be applied した. その results, 1762 t / 64 a - alien では he と more しにた occasions, DNA polymerase alpha (POLA) が intentionally に reduce していることを shows した. POLA と Chk1 の S345 リン acidification には contact な masato even にあるため, HBX の - each variant に masato して, Chk1 の S345 のリン acidification の degree と POLA の発 now レベルについてリアルタイム PCR とイムノブロットで parsing line をなっているところである. In parallel, ててHBX 's 伝 subsidiary <s:1> トラスジェニッスジェニッ <s:1> ウスウス(TG ウスウス) を made a を implementation of た. に HuH7 cells using したものと with じ - を use し, C57BL / 6 マウスにそれぞれの heritage 伝 son を group み込んだ. PCR とサザンブロットによりトランスジーンのを confirm し, それぞれのトランスジーンを ownership する HBX - TG マウスを breeding することができた. Now, each system でトラ, スジ, スジ, <s:1>, ホモ and ホモ operations are being carried out を into めて, る, る. At that time, the <s:1> plan was to successfully propagate に through と and TG ウスウスた. また, the in vitro でのマイクロアレイ parsing により Chk1 と direct な masato even を hold つ POLA heritage 伝を son be した. Cell lines レベルで HBX と Chk1, POLA の masato is sexual を parsing するとに, TG マウスを using して individual レベルで, HBX がものつ liver cells more nuclear agency について beg を検 into める.