頂底極性決定因子CrumbsのmRNA局在化機構の解析

顶底极性决定子Crumbs的mRNA定位机制分析

基本信息

批准号：
09J01309
负责人：
飯岡英和
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J01309/
关键词：
頂底極性上皮細胞 Crumbs 細胞極性 RNA タンパク質培養細胞相互作用 RNA結合タンパク質

项目摘要

上皮細胞に見られる頂底極性は、細胞内で局在する頂底極性決定因子群の働きによって形成される。決定因子の一つCrumbs(Crb)タンパク質は細胞の頂部膜のみに局在し、さらに他の因子との相互作用や細胞骨格の再構成を介して頂底極性の調節・決定に寄与していると考えられる。近年ショウジョウバエ胚においてCrbがmRNAレベルで上皮細胞の頂部側に局在していることが報告された。mRNAレベルのタンパク質局在制御は出芽酵母、ショウジョウバエの生殖系列、哺乳類神経細胞などにおいて、細胞の運命決定や、機能制御に貢献していることが知られているが、哺乳類上皮細胞においてはこれまで知られていなかった。本研究ではCrb mRNAに結合するタンパク質を同定し、Crbの機能、及び、頂底極性の形成における役割を明らかにすることを目的とした。昨年度までに一次スクリーニングとしてRNA結合タンパク検出法を立ち上げた。今年度は、得られた候補タンパク質に対して網羅的にshRNAによるノックダウン実験を行った。その結果、IRSp53を平面培養した上皮細胞内でノックダウンしたところ、Crb mRNAの頂部局在が抑制された。このことはIRSp53がCrb mRNAの局在制御に役割を果たしていることを示唆している。これまでにIRSp53は細胞の突起形成やアクチン細胞骨格の再編成において機能することが報告されているが、RNAの制御に関与するという報告は皆無である。今後はRNA免疫沈降・細胞極性又はシスト形成の観察など、生化学的、細胞生物学的な実験を駆使して、更に詳細な機能解析を慎重に行う予定である。また今年度中にRNA結合タンパク質検出の方法論のみを論文にまとめ、Nucleic Acids Research誌に投稿し、受理された。

上皮细胞中发现的顶部基础极性是由细胞内局部的顶端基础极性决定因素的作用形成的。决定因素之一，即Crumbs（CRB）蛋白，仅定位于细胞的顶膜，并被认为通过与其他因素相互作用并重建细胞骨架，从而有助于调节和测定根尖的基础极性。最近，据报道，CRB位于mRNA水平的果蝇胚胎的上皮细胞的顶端。众所周知，蛋白质在mRNA水平上的定位有助于细胞命运的确定和功能控制，果蝇细菌谱系，哺乳动物神经元等，但对哺乳动物上皮细胞尚不清楚。这项研究旨在鉴定与CRB mRNA结合的蛋白质，并阐明CRB的功能及其在顶端极性形成中的作用。到去年，启动了一种检测RNA结合蛋白的方法作为主要筛查。今年，我们在获得的候选蛋白上使用SHRNA进行了全面的敲低实验。结果，在平面培养的上皮细胞中将IRSP53击倒，从而抑制了CRB mRNA的顶端定位。这表明IRSP53在CRB mRNA的定位调节中起作用。迄今为止，据报道IRSP53在细胞突起形成和肌动蛋白细胞骨架重排中起作用，但据报道没有任何涉及RNA调节。将来，我们计划使用生化和细胞生物学实验仔细地进行更详细的功能分析，例如观察RNA免疫沉淀以及细胞极性或囊肿的形成。此外，在本财政年度，仅将RNA结合蛋白检测的方法汇编成纸张，并提交给核酸研究杂志，该研究已被接受。