哺乳類精子鞭毛における分子アーキテクチャーの研究

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申請者がクローニングしたTektin5およびGcl-2は蛋白質の局在と特徴から、軸糸周辺構造体を統合して機能的な鞭毛構造を作り出すための細胞骨格として働くことが推測された。さらにTektin5をbaitとした酵母Two-Hybrid法によって単離したTektin5と相互作用する分子、Tektin4およびOdfl、およびGcl-2をbaitとした酵母Two-Hybrid法によって単離したGcl-2と相互作用する分子、Gcl-2BP1はこれらの分子間結合によって、哺乳類精子鞭毛の構造維持や運動の増幅に関与していると考えられる。そこでTektin4、Odf1およびGcl-2BPIについて、1、遺伝子の発現解析および蛋白質の発現・局在解析、2、分子間相互作用の解析、を行った。1、Tektin4、Odf1は既知遺伝子であり、論文等により、Tektin4についてはmRNAは4週齢以降発現し、蛋白質は精子鞭毛中片・主部のODF皮質に局在する、Odf1についてはmRNAは30日齢以降発現し、蛋白質は精子鞭毛の中片に局在することが分かった。Gcl-2BP1については、臓器別RT-PCRの結果、mRNAは精巣・肺・心臓で発現が見られ、週齢別RT-PCRの結果、3週齢以降で発現が見られた。さらに、1%S-EDTAで処理を行った精子のウエスタンブロットの結果、Gcl-2BP1は1%S-EDTAでは溶出しない分画に検出された。また、精子の免疫染色の結果、精子鞭毛中片に局在することが確認された。2、Tektin5とTektin4およびTektin5とOdf1について、哺乳類培養細胞を用いて発現解析を行ったところ、Tektin5とTektin4およびTektin5とOdf1の細胞内における局在が一致した。さらに哺乳類培養細胞をもちいたTwo-Hybrid法によってTektin5とTektin4およびTektin5とOdf1の分子間相互作用の解析を行った結果、これらが細胞内において相互作用していることが確認された。このように得られた分子について解析することで、Tektin5およびGcl-2の精子鞭毛における存在意義、即ち生理的機能を解明することが出来る。