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熱安定性の高いRNAとタンパク質の複合体の創製

创建高度热稳定的 RNA-蛋白质复合物

基本信息

批准号：
09J03369
负责人：
林宏典
金额：
$ 0.45万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J03369/
关键词：
超好熱菌 RNAとタンパク質の複合体熱安定性酵素

项目摘要

本研究では複合体の結晶構造及びRNAとの相互作用形式が解明されており、尚かつ80℃以上で生育可能な超好熱菌内において機能するH/ACA Box RNPを基に設計した基本骨格を用いて、望みの機能を有し熱安定性の高い機能性RNPを構築する方法論の開発を試みている。本年度は、(1)基本骨格として用いるRNA部位及びタンパク質部位の決定と、(2)超好熱菌のタンパク質の発現、精製法及び分子設計によるapADHの機能改変について学ぶ事を目的に研究を行った。(1)RNA部位及びタンパク質部位の決定H/ACA Box RNPを構成している1つのRNA(guide RNA)及び4つのタンパク質サブユニット(Cbf5,Nop10,L7Ae,Gar1)の内から基本骨格として用いる部位の選択を行った。タンパク質サブユニットに関しては、論文及び結晶構造を基にRNAと最も相互作用面が大きいCbf5及び最もアミノ酸数が少なくH/ACA Box RNPの構造変化に寄与すると考えられるNop10をタンパク質サブユニットとして選択した。guide RNAに関しては、論文を基にCbf5及びNop10との相互作用部位の確認を行いCbf5及びNop10との相互作用を保持した最小限のRNA単位及びランダム領域の導入箇所を決定した。(2)超好熱菌由来のタンパク質の発現、精製法及び機能改変について超好熱菌由来のタンパク質の発現、精製法及び機能改変について学ぶ為に超好熱菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(apADH)を用いて超好熱菌由来タンパク質の発現及び精製を行い、更にモデリングソフトを用いた分子設計によりapADHを熱安定性の高いホルムアルデヒドジスムターゼ(FDM)に機能改変する事を試みた。超高熱菌の精製法の習得、8種類のapADH変異体の作製及び熱安定性の評価を行った。

In this study, the crystal structure of the complex and the interaction between RNA and RNA were clarified, and the H/ACA Box RNP was designed based on the basic skeleton structure, functional structure, thermal stability and functional RNP construction methodology. This year, we conducted research on (1) the determination of RNA sites and DNA sites in basic DNA, and (2) the development, purification and molecular design of DNA from super-good bacteria, and the functional modification of apADH. (1)RNA site and quality site determination H/ACA Box RNP is composed of RNA(guide RNA) and RNA(guide RNA). The structure of the RNP is characterized by a large interaction surface Cbf5 and a small interaction surface H/ACA Box Nop10. The interaction between Cbf 5 and Nop 10 is determined by the minimum RNA position and the introduction of the domain. (2)The origin, purification and functional modification of super-good thermobacteria are discussed in detail. The origin, purification and functional modification of super-good thermobacteria are discussed in detail in detail. In addition, the molecular design of apADH for high thermal stability and functional modification of FDM are also studied. The learning of the purification method of ultra-high heat bacteria, the production of 8 types of apADH variants, and the evaluation of thermal stability were carried out.