熱安定性の高いRNAとタンパク質の複合体の創製

本研究では複合体の結晶構造及びRNAとの相互作用形式が解明されており、尚かつ80℃以上で生育可能な超好熱菌内において機能するH/ACA Box RNPを基に設計した基本骨格を用いて、望みの機能を有し熱安定性の高い機能性RNPを構築する方法論の開発を試みている。本年度は、(1)基本骨格として用いるRNA部位及びタンパク質部位の決定と、(2)超好熱菌のタンパク質の発現、精製法及び分子設計によるapADHの機能改変について学ぶ事を目的に研究を行った。(1)RNA部位及びタンパク質部位の決定H/ACA Box RNPを構成している1つのRNA(guide RNA)及び4つのタンパク質サブユニット(Cbf5,Nop10,L7Ae,Gar1)の内から基本骨格として用いる部位の選択を行った。タンパク質サブユニットに関しては、論文及び結晶構造を基にRNAと最も相互作用面が大きいCbf5及び最もアミノ酸数が少なくH/ACA Box RNPの構造変化に寄与すると考えられるNop10をタンパク質サブユニットとして選択した。guide RNAに関しては、論文を基にCbf5及びNop10との相互作用部位の確認を行いCbf5及びNop10との相互作用を保持した最小限のRNA単位及びランダム領域の導入箇所を決定した。(2)超好熱菌由来のタンパク質の発現、精製法及び機能改変について超好熱菌由来のタンパク質の発現、精製法及び機能改変について学ぶ為に超好熱菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(apADH)を用いて超好熱菌由来タンパク質の発現及び精製を行い、更にモデリングソフトを用いた分子設計によりapADHを熱安定性の高いホルムアルデヒドジスムターゼ(FDM)に機能改変する事を試みた。超高熱菌の精製法の習得、8種類のapADH変異体の作製及び熱安定性の評価を行った。

本研究では複合体の結晶構造及びRNAとの相互作用形式が解明されており、尚かつ80℃以上で生育可能な超好熱菌内において機能するH/ACA Box RNPを基に設計した基本骨格を用いて、望みの機能を有し熱安定性の高い機能性RNPを構築する方法論の開発を試みている。本年度は、(1)基本骨格として用いるRNA部位及びタンパク質部位の決定と、(2)超好熱菌のタンパク質の発現、精製法及び分子設計によるapADHの機能改変について学ぶ事を目的に研究を行った。(1)RNA部位及びタンパク質部位の決定H/ACA Box RNPを構成している1つのRNA(guide RNA)及び4つのタンパク質サブユニット(Cbf5,Nop10,L7Ae,Gar1)の内から基本骨格として用いる部位の選択を行った。タンパク質サブユニットに関しては、論文及び結晶構造を基にRNAと最も相互作用面が大きいCbf5及び最もアミノ酸数が少なくH/ACA Box RNPの構造変化に寄与すると考えられるNop10をタンパク質サブユニットとして選択した。guide RNAに関しては、論文を基にCbf5及びNop10との相互作用部位の確認を行いCbf5及びNop10との相互作用を保持した最小限のRNA単位及びランダム領域の導入箇所を決定した。(2)超好熱菌由来のタンパク質の発現、精製法及び機能改変について超好熱菌由来のタンパク質の発現、精製法及び機能改変について学ぶ為に超好熱菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(apADH)を用いて超好熱菌由来タンパク質の発現及び精製を行い、更にモデリングソフトを用いた分子設計によりapADHを熱安定性の高いホルムアルデヒドジスムターゼ(FDM)に機能改変する事を試みた。超高熱菌の精製法の習得、8種類のapADH変異体の作製及び熱安定性の評価を行った。