細胞周期制御因子による非相同末端結合の新規調節メカニズムの解析

細胞周期に依存して活性を変えるCDKがDSB修復に必要であることから、細胞周期を通した染色体の変化に応じた、修復経路の制御が存在すると考えられる。これまでの研究から、NHEJ因子の一つLif1がCDKのターゲットであることを明らかにした。そこで今回は、このLif1のリン酸化の機能についての解析を行った。Lif1タンパク質の一次配列から、CDKのリン酸化候補部位を見つけ、CDKによる直接のリン酸化部位か調べた。この結果、CDKによるリン酸化部位がLif1上の261番目のセリンであることが分かった。さらに、非リン酸化変異株(lif1-CDKd、S261A)を作製し、その機能の解析を行った。この株を用い、染色体免疫沈降(ChIP)を行った結果、lif1-CDKd変異株では、DSBへの結合能が低下していた。次に、In vitroのライゲーション反応を行うため、大腸菌からLif1タンパクを精製したが、精製したLif1は分解されやすくライゲーション反応には使用できなかった。しかし、In vitroでのリン酸化反応には使用でき、直接CDKによるLif1のリン酸化を証明することができた。また、Lif1のリン酸化のDNAリガーゼ複合体形成への影響を明らかにするため、共免疫沈降により、複合体構成因子間の相互作用を調べた。この結果、既存の複合体構成因子との相互作用は野生株と同様に検出できた。しかし今回、新規の相互作用因子Sae2との相互作用を新たに発見し、この相互作用を介してLif1のリン酸化が機能している可能性を得られた。また、このSae2、Lif1とCDKの関係に焦点を当て、解析した。

細胞周期に依存して活性を変えるCDKがDSB修復に必要であることから、細胞周期を通した染色体の変化に応じた、修復経路の制御が存在すると考えられる。これまでの研究から、NHEJ因子の一つLif1がCDKのターゲットであることを明らかにした。そこで今回は、このLif1のリン酸化の機能についての解析を行った。Lif1タンパク質の一次配列から、CDKのリン酸化候補部位を見つけ、CDKによる直接のリン酸化部位か調べた。この結果、CDKによるリン酸化部位がLif1上の261番目のセリンであることが分かった。さらに、非リン酸化変異株(lif1-CDKd、S261A)を作製し、その機能の解析を行った。この株を用い、染色体免疫沈降(ChIP)を行った結果、lif1-CDKd変異株では、DSBへの結合能が低下していた。次に、In vitroのライゲーション反応を行うため、大腸菌からLif1タンパクを精製したが、精製したLif1は分解されやすくライゲーション反応には使用できなかった。しかし、In vitroでのリン酸化反応には使用でき、直接CDKによるLif1のリン酸化を証明することができた。また、Lif1のリン酸化のDNAリガーゼ複合体形成への影響を明らかにするため、共免疫沈降により、複合体構成因子間の相互作用を調べた。この結果、既存の複合体構成因子との相互作用は野生株と同様に検出できた。しかし今回、新規の相互作用因子Sae2との相互作用を新たに発見し、この相互作用を介してLif1のリン酸化が機能している可能性を得られた。また、このSae2、Lif1とCDKの関係に焦点を当て、解析した。