膜型TNFの細胞表面への表出機構とその内向きシグナルの解明及び炎症性疾患への応用

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1.膜型TNFの細胞表面への表出機構:TNF変換酵素で切断されない変異型ヒトTNF-αを作製し、ヒトT細胞株にelectroporation法で遺伝子導入した。マウスMφでTNFの細胞表面への表出に必須と報告されているVamp-3を膜型TNF発現細胞に導入し、膜型TNFの発現レベルを検討した。マウスMφとは対照的に、膜型TNFの発現量はむしろ減少した。またLipid raft阻害剤下では膜型TNFの発現量は上昇する傾向にあり、膜型TNFの細胞表面への表出にはraftの形成は必須ではないと考えられた。ヒト末梢血では活性化T細胞やNK細胞が多く膜型TNFを発現し、クローン病では病態形成に活性化T細胞が重要であると考えられている。それ故ヒトT細胞における膜型TNFの発現機構を解明することで治療に応用できる可能性がある。少なくともマウスとヒトあるいはMφとT細胞でそのメカニズムが異なると考えられ、ヒトSNAREファミリー分子を発現ベクターに網羅的にsubcloningし、さらにsiRNAをテザインした。2.表出後の膜型TNFの移動:膜型TNF発現細胞をその標的細胞と共培養を行い、膜型TNFの動態を観察した。膜型TNFはMφの細胞膜上へ速やかに細胞間移動した。また4℃でも同様に移動した。その方向はドナー側と同じくN末端が細胞内、C末端が細胞外であった。TNF受容体1型のみまたは2型のみを発現した細胞株を作製し、膜型TNF発現細胞と共培養した。TNF受容体1型と2型いずれも膜型TNFの細胞間移動が認められ、その程度は同等であった。この現象は膜型TNF発現細胞を4%PFAで固定すると抑制された。移動した膜型TNFはリガンドとしての活性を維持していた。炎症局所では活性化リンパ球が細胞-細胞間会合によりリガンドを受け渡していくことにより、炎症が促進していくことが想定された。