真核生物におけるtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質認識機構の解析

真核生物tRNA剪接核酸内切酶底物识别机制分析

• 批准号: 09J05512
• 负责人: 小野寺 瑛宣
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Rikkyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J05512/
• 关键词: tRNAスプライシング; スプライシングエンドヌクレアーゼ; C.merolae; シゾン; 酵母Two-Hybrid法; transfer RNA; tRNA splicing endonuclease; Cyanidioschyzon merolae

1.C.merolaeのtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの取得とその活性の解析出芽酵母ゲノムとの相同性検索によって見出されたC.merolaeのtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ遺伝子候補であるCmSen2,CmSen 34,CmSen 54から各タンパク質を大腸菌を宿主にして産生させる試みを行った。様々な培養条件を試みた結果、低温培養によりCmSen2、CmSen34が可溶性のタンパク質として得られた。これらのタンパク質を精製し、基質RNAと混合したが、エンドヌクレアーゼ活性は検出されなかった。複数のサブユニットを同時に発現させることにより活性型タンパク質の取得が成功した例が報告されているため、3種のCmSenサブユニットを同時に発現させるために単一のプラスミド上に3種のCmSenをクローニングしたプラスミドを作成し、同時発現系を構築した。その結果、3種ともに可溶性のタンパク質として得られたが、CmSen54の発現量が低く、引き続き発現の条件検討を行っている。2.酵母Two-Hybrid法によるエンドヌクレアーゼサブユニットに相互作用するタンパク質の探索酵母Two-Hybrid法により、CmSen2,CmSen34,CmSen54のそれぞれをbaitにして、相互作用するタンパク質を探索した。その結果、CmSen2をbaitにした場合、Cmsen54との相互作用が示唆された。この結果は、3つのサブユニットが会合して機能している可能性を支持する。出芽酵母では、上述の3つに加えてもう1つのSen 15がtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニットであるが、C.merolaeの配列の相同性からはSen15は見いだせなかった。本解析により、機能的にSen15に相当するタンパク質が同定できることを期待して解析を続けている。

1。获取tRNA剪接内切核酸酶及其活性的分析，我们试图从CMSEN2，CMSEN 34和CMSEN 54中产生蛋白质，这些蛋白质是Merolae trna剪接内核核酸内核酸内切核蛋白酶胶质核酸念珠菌基因的候选者，该基因通过使用大肠杆菌的培养酵母基因组来搜索同性恋，并使用大肠杆菌。尝试各种培养条件后，通过低温培养获得CMSEN2和CMSEN34作为可溶性蛋白。将这些蛋白质纯化并与底物RNA混合，但未检测到内核酸酶活性。由于有报道称通过同时表达多个亚基通过同时表达活性蛋白的报道，因此将三种CMSEN类型克隆到单个质粒上的质粒同时表达了三个CMSEN亚基，并构建了共表达系统。结果，所有三种类型均作为可溶性蛋白获得，但是CMSEN54的表达水平较低，并且仍在研究表达条件。 2。搜索与酵母双杂交方法相互作用的蛋白质使用酵母两杂化方法，CMSEN2，CMSEN34和CMSEN54被诱饵以寻找相互作用的蛋白质。结果，当CMSEN2是诱饵时，建议它与CMSEN54相互作用。该结果支持三个亚基可以关联和功能的可能性。在萌芽的酵母中，除了上面的三个外，另一个sen 15是tRNA剪接核酸内切酶的亚基，但在Merolae的序列同源性中未发现SEN 15。我们正在继续进行分析，希望这种分析能够使我们能够识别出与SEN15相当的蛋白质。