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In-Cell NMRによる膜タンパク質のダイナミクス解析法開発とチャネルへの応用

使用In-Cell NMR开发膜蛋白动力学分析方法及其在通道中的应用

基本信息

批准号：
09J08197
负责人：
吉中藍 (新津藍)
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J08197/
关键词：
固体NMR 神経毒相互作用解析

项目摘要

本研究では、電位依存性ナトリウムチャネル(以下VSSC)の非活性化状態と神経毒ベラトリジンによる活性化状態の構造変化をIn-Cell NMRにより観測することを計画していた。VSSCの構造解析を行うにあたり、まずVSSCにおいてベラトリジンが相互作用すると考えられているチャネル孔形成部位の構造を解析することが本研究の目的遂行において有用であると考えた。そこで、ベラトリジンの作用が提唱されているVSSCのドメイン4セグメント6(以下D4S6)の配列の両端に親水性アミノ酸であるリシンを3残基ずつ配列したペプチド(以下TMP3)を用い、固体NMRで脂質二重膜中での構造解析を行うこととした。モデルペプチドとして、D4S6全長の28残基の両端にリシンを3残基ずつ加えた34残基のTMP3を固相合成により調製した。特に固体NMR測定用のTMP3については、Ile、Leu、Val、Gly、Phe、Alaにおいて固体NMR測定の際に必要な13C標識アミノ酸を用いた。続いてTMP3の再構成条件の検討を行った。D4S6は細胞膜中で・-helixを形成していると考えられることから、円偏光二色性スペクトルおよび固体NMRで二次構造をモニターしながら条件を絞り込んだ。膜タンパク質再構成の際に利用される界面活性剤除去法、押し出し法、薄膜水和法を種々の条件で試みた。その結果、薄膜水和法の一条件によって均一な・-helixを形成したTMP3を脂質二重膜中へ再構成することができた。再構成したTMP3を用いて二次元13C-13Cスペクトル測定、脂質重水素-ペプチドプロトンの距離測定を行った。さらに仮想膜モデルを用いたレプリカ交換分子動力学法により得られたTMP3の10000個の構造群に対しスペクトルをシミュレーションにより予測し、先に観測されたスペクトルと比較することでTMP3の三次元構造を決定した。以上の固体NMR分析および分子動力学法から、TMP3は膜貫通・-helixであることが示された(Figure1)。また得られた構造はナトリウムチャネルのD4S6の構造を反映していると考えられたことから、現在再構成TMP3とVTDの複合体解析に進んでいる。

In this study, the structure transformation of the inactive state and the active state of the potential-dependent molecule (hereinafter VSSC) was studied by In-Cell NMR. The structure analysis of VSSC is useful for the purpose of this study. In addition, the role of the amino acid residues in the sequence of VSSC was also discussed. The structure analysis of lipid double membrane was carried out by solid-state NMR. D4S6 is composed of 28 residues at the end of D4S6, 34 residues at the end of D4S6, and 3 residues at the end of D4S6. In particular, TMP, Ile, Leu, Val, Gly, Phe and Ala are essential for solid state NMR determination. The reconstruction conditions of TMP 3 were discussed. D4S6-helix formation in cell membrane, polarization dichroism and solid-state NMR secondary structure The conditions for membrane quality reconstruction were studied by using interfacial active agent removal method, extrusion method and thin film water method. As a result, a condition for thin film water and method is uniform. -helix formation. TMP 3 was re-constructed using the 13C-13C matrix to determine the distance between the two components. In order to determine the three-dimensional structure of TMP 3, the molecular dynamics method was used to predict the structure of TMP 3. The above solid state NMR analysis was performed by molecular dynamics method, TMP 3 membrane penetration was observed (Figure 1). The structure of D4S6 is reflected in the structure of TMP3 and VTD.