遺伝子改変ブタ及びクローンブタを用いたトランスレーショナル・リサーチに関する研究

【実施内容】我々は、レトロウイルスベクターを用いてKusabira-Orange(huKO)遺伝子を導入した、全身性に赤色蛍光を示す遺伝子改変(Tg)クローンブタの作出に成功している。前年度に引き続き、このTgクローンブタの後代産仔を作出し、産仔における遺伝子伝達動態ならびにその表現型を解析した。本年度は、前年度に獲得した第1世代(G1)雄の凍結精子から、人工授精(AI)あるいは体外受精(IVF)によって第2世代(G2)産仔を作出することに成功した。G2世代は12回の分娩で77頭(雌:34頭、雄:43頭)の産仔が得られ、そのうち39頭がTgであった。Tg産仔率は50.6%(39/77)であり、メンデリズムに従ってhuKO遺伝子が後代に伝達されていることが確認された。さらに、Founder Tgクローン世代、G1、G2世代ブタのhuKO遺伝子はFISH解析により第17染色体q12領域の一箇所に挿入されていることが確認された。G2世代の個体にはFounder Tgクローンに見られた全身性赤色蛍光発現の表現型が引き継がれていた。得られたTg産仔は、靭帯再建研究、ハイドロキシアパタイトを用いた骨修復研究、新生仔肝細胞移植研究(いずれも共同研究)に使用され、赤色蛍光の細胞マーカーとしての有用性が実証された。【意義・重要性】レトロウイルスベクターにより導入されたhuKO遺伝子は2世代の有性生殖を経た後もジーンサイレンシングを受けることなく発現が維持されること、導入されたhuKO遺伝子はFISH解析により染色体上の一箇所に1コピー挿入されていることが明らかになったことは、Tg動物として系統化を図る上で重要な知見である。すなわち、継代によって導入遺伝子のコピー数が変動しない、安定的なTgブタの系統が確立されたと言える。獲得したhuKO後代産仔が整形外科、小児科、再生医療等の研究に用いられ、顕著な果が上がっていることから、本研究の最終目的であるへのhuKO Tgブタの利用が十分に達成できたと考える。凍結精子を用いた、体外受精や人工授精による増殖法も確立されたので、今後一層huKO Tgブタの研究利用が進展すると考えられる。

【実施内容】我々は、レトロウイルスベクターを用いてKusabira-Orange(huKO)遺伝子を導入した、全身性に赤色蛍光を示す遺伝子改変(Tg)クローンブタの作出に成功している。前年度に引き続き、このTgクローンブタの後代産仔を作出し、産仔における遺伝子伝達動態ならびにその表現型を解析した。本年度は、前年度に獲得した第1世代(G1)雄の凍結精子から、人工授精(AI)あるいは体外受精(IVF)によって第2世代(G2)産仔を作出することに成功した。G2世代は12回の分娩で77頭(雌:34頭、雄:43頭)の産仔が得られ、そのうち39頭がTgであった。Tg産仔率は50.6%(39/77)であり、メンデリズムに従ってhuKO遺伝子が後代に伝達されていることが確認された。さらに、Founder Tgクローン世代、G1、G2世代ブタのhuKO遺伝子はFISH解析により第17染色体q12領域の一箇所に挿入されていることが確認された。G2世代の個体にはFounder Tgクローンに見られた全身性赤色蛍光発現の表現型が引き継がれていた。得られたTg産仔は、靭帯再建研究、ハイドロキシアパタイトを用いた骨修復研究、新生仔肝細胞移植研究(いずれも共同研究)に使用され、赤色蛍光の細胞マーカーとしての有用性が実証された。【意義・重要性】レトロウイルスベクターにより導入されたhuKO遺伝子は2世代の有性生殖を経た後もジーンサイレンシングを受けることなく発現が維持されること、導入されたhuKO遺伝子はFISH解析により染色体上の一箇所に1コピー挿入されていることが明らかになったことは、Tg動物として系統化を図る上で重要な知見である。すなわち、継代によって導入遺伝子のコピー数が変動しない、安定的なTgブタの系統が確立されたと言える。獲得したhuKO後代産仔が整形外科、小児科、再生医療等の研究に用いられ、顕著な果が上がっていることから、本研究の最終目的であるへのhuKO Tgブタの利用が十分に達成できたと考える。凍結精子を用いた、体外受精や人工授精による増殖法も確立されたので、今後一層huKO Tgブタの研究利用が進展すると考えられる。