ライブラリ共有結合導入によるオリゴ糖転移酵素・基質相互作用安定化と複合体構造決定

通过共价文库引入稳定寡糖转移酶-底物相互作用和确定复杂结构

• 批准号: 21770115
• 负责人: 井倉 真由美
• 金额: $ 2.25万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21770115/
• 关键词: 膜タンパク質; オリゴ糖転移酵素; X線結晶解析; 古細菌

1. 大腸菌で発現させた古細菌P.furiosusのStt3全長タンパク質の大量調製本酵素はIPTG誘導後に、細胞毒性によると考えられるホスト大腸菌の死滅という問題があった。この問題は、ホストの大腸菌をBL21(DE3)からC43(DE3)に代えることで改善がみられた。さらに、C43(DE3)pLyssについても検討を行ったが、改善されなかった。誘導後の培養温度を検討したところ16℃より37℃で培養した方がOSTの回収量が多いことがわかった。また、可溶化の際の界面活性剤について検討を行った。その結果、ThtonX-100、オクチルグルコシド、ドデシルマルトシドのどの界面活性剤を用いてもOST活性に差は見られなかった。今後はドデシルマルトシドを用いて可溶化を行う。2. 基質(糖鎖修飾アミノ酸配列)のデザインAsn-X-Thr/Serが糖鎖修飾のコンセンサス配列であるが、Xのアミノ酸残基の違いにより糖転移の効率が異なることが知られている。そこで、Xの各位置のアミノ酸残基を19種類変えた蛍光標識ペプチドを作製し、P.furiosus菌体より精製したOSTを用いて活性を測定した。電気泳動により反応物を分離し、蛍光イメージを用いて蛍光検出を行った。その結果、XがValの時に最も活性が高いことがわかった。また、Xの次のアミノ酸をThrもしくはSerにしてOST活性を測定したところ、Xの次のアミノ酸残基がThrの方がOST活性が3倍程度高いことがわかった。そこで今後は、今回デザインしたAsn-Val-Thrを最適配列として用いる。

1. E. coli is found in archaea P. furiosus and its Stt3 full-length protein is modulated in large quantities. After IPTG induction, cytotoxicity is examined and E. coli is killed. This problem is caused by Escherichia coli BL21 (DE3) and C43(DE3). C43(DE3)pLyss are used to improve the quality of products. After induction, the incubation temperature is 16℃, the incubation temperature is 37℃, and the recovery amount of OST is more than 30 ℃. The interface active agent in the solubilization process is discussed. The results showed that ThonX-100, Crotone, and Crotone were used in the study of OST activity. In the future, the solution will be used in the solution. 2. Asn-X-Thr/Ser is the amino acid sequence of the matrix (sugar lock modification). The amino acid sequence of the sugar lock modification is Asn-X-Thr. 19 kinds of acid residues in each position of P. furiosus were determined. The electric shock wave is emitted by the laser beam. The result is that X is the most active when Val is active. The OST activity of the secondary acid residues of X was 3-fold higher than that of Ser. Asn-Val-Thr is the most suitable column in the future.

项目成果

大腸菌膜に発現させたオリゴ糖転移酵素の精製と結晶化

大肠杆菌膜中表达的寡糖转移酶的纯化和结晶

• 发表时间: 2009
• 作者: Wada;K.;Sumi;N.;Nagai;R.;Iwasaki;K.;Sato;T. Suzuki;K.;Nagasaka;Y.;Minami.;Y.;Outten;F.W.;Takahashi;Y.;Fukuyama.;K.;北野健;井倉真由美
• 通讯作者: 井倉真由美

Comparative Structural Biology of Eubacterial and Archaeal Oligosaccharyltransferases

• DOI: 10.1074/jbc.m109.081752
• 发表时间: 2010-02-12
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Maita, Nobuo;Nyirenda, James;Kohda, Daisuke
• 通讯作者: Kohda, Daisuke