胸腺でのT細胞分化・増殖におけるGRKの機能解析と自己免疫疾患での役割

GRK在胸腺T细胞分化和增殖中的功能分析及其在自身免疫性疾病中的作用

• 批准号: 21790948
• 负责人: 河野 政志
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21790948/
• 关键词: GRK-2; shRNA発現レンチウイルスベクター

胸腺でのT細胞分化・増殖におけるG-ptotein coupled receptor kinase 2(GRK2)の機能解析を行うために、まずGRK2をターゲットとしたレンチウイルスベクタープラスミドを作成した。GRK2を効率よくノックダウンするために、GRK2をターゲットとしたshRNAを2種類デザインして、これを発現するshRNA発現レンチウイルスベクタープラスミドを構築した。そしてこのプラスミドを用いて大腸菌への形質転換によるプラスミド増幅、生成を行った。生成したプラスミドをHEK293T細胞に3種類のパッケージングプラスミドと同時にco-transfectionを行い、48時間後に上清を回収、濃縮することによりshRNA発現レンチウイルスを作成した。レンチウイルスのタイターはウイルスをHEK293Tへ感染させた後、レンチウイルスベクターに組み込まれたGFP発現をフローサイトメトリーにて解析することにより行った。平均40-45%の細胞がGFPを発現、すなわちウイルスに感染しており、これから計算すると約3.2×10^8 viral particles/mlのレンチウイルスが一回のtransfectionで精製できた。GRK2に対するshRNAによるノックダウン効果の確認のため、RAW246.7細胞にshRNA発現レンチウイルスベクターを感染させ、total RNAを調整した。コントロールウイルスを感染させたRAW246.7細胞からもtotal RNAを調整し、これらを用いてreal time PCRにてGRK2 mRNAの発現を比較することにより、shRNAによるノックダウン効率を検討した。shRNA発現レンチウイルスベクター感染細胞ではコントロールに比べて、約35-40%のGRK2 mRNA低下を認めた。

The functional analysis of G-ptotin coupled receptor kinase 2(GRK2) in thymus T cell differentiation and proliferation was carried out. GRK2 shRNA is constructed from two types of shRNA: GRK2 shRNA and GRK2 shRNA. In addition, the production of E. coli in the form of a variety of bacteria can be increased. HEK293 T cells were generated from three different types of shRNA and co-transfection. After 48 hours, the supernatant was recovered and concentrated. HEK293T is a highly sensitive and sensitive medium for the detection of GFP. On average, 40-45% of the cells were infected with GFP, which was calculated to be about 3.2×10^8 viral particles/ml. GRK2 shRNA expression in RAW246.7 cells was confirmed by infection and total RNA regulation. RAW246.7 cells infected with GRK2 mRNA are regulated by total RNA and compared with GRK2 mRNA expression by real time PCR. shRNA expression in cells infected with GRK2 mRNA was 35-40% lower than that in cells infected with shRNA.

项目成果

Peroxisome proliferator-activated receptor α and γ agonisits enhance Human regulatory T cell function and induction

过氧化物酶体增殖物激活受体 α 和 γ 激动剂增强人类调节性 T 细胞功能和诱导

• 发表时间: 2009
• 作者: Hasegawa H;Lei J;Kohno M;et al.
• 通讯作者: et al.

Amelioration of lupus nephritis with dendritic cells using a NF-kappa Bdecoy and histone H3 peptide in NZB/WF1 mice

使用 NF-kappa Bdecoy 和组蛋白 H3 肽在 NZB/WF1 小鼠中通过树突状细胞改善狼疮性肾炎

• 发表时间: 2009
• 作者: Hasegawa H;Inoue A;Kohno M;et al.
• 通讯作者: et al.