胸腺でのT細胞分化・増殖におけるGRKの機能解析と自己免疫疾患での役割

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胸腺でのT細胞分化・増殖におけるG-ptotein coupled receptor kinase 2(GRK2)の機能解析を行うために、まずGRK2をターゲットとしたレンチウイルスベクタープラスミドを作成した。GRK2を効率よくノックダウンするために、GRK2をターゲットとしたshRNAを2種類デザインして、これを発現するshRNA発現レンチウイルスベクタープラスミドを構築した。そしてこのプラスミドを用いて大腸菌への形質転換によるプラスミド増幅、生成を行った。生成したプラスミドをHEK293T細胞に3種類のパッケージングプラスミドと同時にco-transfectionを行い、48時間後に上清を回収、濃縮することによりshRNA発現レンチウイルスを作成した。レンチウイルスのタイターはウイルスをHEK293Tへ感染させた後、レンチウイルスベクターに組み込まれたGFP発現をフローサイトメトリーにて解析することにより行った。平均40-45%の細胞がGFPを発現、すなわちウイルスに感染しており、これから計算すると約3.2×10^8 viral particles/mlのレンチウイルスが一回のtransfectionで精製できた。GRK2に対するshRNAによるノックダウン効果の確認のため、RAW246.7細胞にshRNA発現レンチウイルスベクターを感染させ、total RNAを調整した。コントロールウイルスを感染させたRAW246.7細胞からもtotal RNAを調整し、これらを用いてreal time PCRにてGRK2 mRNAの発現を比較することにより、shRNAによるノックダウン効率を検討した。shRNA発現レンチウイルスベクター感染細胞ではコントロールに比べて、約35-40%のGRK2 mRNA低下を認めた。