イネにおける高温ストレス応答に対する植物SUMO修飾機構の細胞機能研究

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本年度は質量分析器によるSUMO標的タンパク質の同定効率を高めること、異なるSUMO分子種間の標的タンパク質の同定を目標として研究を行った。標識タンパクを融合したSUMO分子を構成的に発現させるベクターを導入したイネ培養細胞を作成し、通常条件または高温条件に曝露した後、抗タグ抗体を用いた共免疫沈降法によりSUMOと直接・間接的に相互作用するタンパク質を精製し、質量分析器(LC-MS/MS)により標的タンパク質を同定した。この際、2種の濃度の分離ゲルを用いてサイズ分画し、ゲル内消化後のショットガンMS/MSを行う事により、同定効率を高める事に成功した。また、同様の方法により互いに異なるSUMO分子種、SUMO1、SUMO2、SUMO3について、比較解析を行った。その結果、SUMO1、SUMO2、SUMOO3と直接・間接的に相互作用するタンパク質として同定された約700のタンパク質のうち、いずれのSUMOにも相互作用するタンパク質が約250あった。また、SUMO2に相互作用するタンパク質のうちSUMO2特異的なものは10%のみであり、残りの大半はSUMO1と共通するターゲットであったことから、SUMO1/2は競合的に標的タンパク質に結合し、その際、SUMO1の親和性がより高いと考えられた。また、高温ストレスへの応答について、タグ抗体を用いた共免疫沈降後のタンパク質の抗SUMO1/2抗体によるウェスタンブロッティングにより解析した。その結果、高温処理によりSUMO1/2に結合・相互作用するタンパク質の増大とともに、フリーのSUMO1/2もその発現が増大する事が明らかになった。一方、SUMO3は構成的に発現していたが、標的タンパク質との結合は高温条件下で特異的に誘導されていた。