ヒト人工染色体を用いた血友病の新規治療法の開発

血液凝固第VIII因子の遺伝子異常により発症する血友病Aでは、主にウイルスベクターを用いた遺伝子治療法の開発が進められてきたが、抗ウイルス抗体の出現やがん化の懸念などが払拭できない。本研究は、宿主染色体とは独立かつ安定に保持され、自律複製するヒト人工染色体ベクター(HAC)を用いて、安全性の高い遺伝子治療法を開発することを目的としている。本年度は、VIII因子搭載HACを血友病Aモデルマウス由来iPS細胞(前年度に樹立済み)に微小核細胞融合法を用いて導入し、得られたクローンの解析を行った。細胞融合後に出現した薬剤耐性クローンのうち、ゲノムPCR法により搭載したVIII因子遺伝子の存在を確認でき、また、キナクリン・ヘキスト染色および蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析にて正常核型かつVIII因子搭載HACを独立保持するクローンを4つ取得した。免疫染色法およびRT-PCR法にて初期化4因子の発現消失が認められ、かつ未分化マーカーの発現を認めた2クローンでOP9共培養法によるin vitro分化誘導を行い、RT-PCR法にて巨核球・血小板へ分化したサンプルのみでVIII因子の発現を確認した。本ベクターは巨核球・血小板特異的な発現を誘導するplatelet factor-4(PF4)プロモーターを用いていることから、in vitroにおいてではあるが、組織特異的にVIII因子の発現を誘導することを示した。一方、前年度に構築したVIII因子搭載マウス人工染色体(MAC)もまた同モデルマウス由来iPS細胞に導入して同様にクローンを8つ取得し、モデルマウスを用いたin vivoでの治療効果の検証のために使用可能なクローンを選定した。実際の治療効果の検証まではできなかったが、本年度までの研究でそのための資材を揃えることができた。

血液凝固第VIII因子の遺伝子異常により発症する血友病Aでは、主にウイルスベクターを用いた遺伝子治療法の開発が進められてきたが、抗ウイルス抗体の出現やがん化の懸念などが払拭できない。本研究は、宿主染色体とは独立かつ安定に保持され、自律複製するヒト人工染色体ベクター(HAC)を用いて、安全性の高い遺伝子治療法を開発することを目的としている。本年度は、VIII因子搭載HACを血友病Aモデルマウス由来iPS細胞(前年度に樹立済み)に微小核細胞融合法を用いて導入し、得られたクローンの解析を行った。細胞融合後に出現した薬剤耐性クローンのうち、ゲノムPCR法により搭載したVIII因子遺伝子の存在を確認でき、また、キナクリン・ヘキスト染色および蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析にて正常核型かつVIII因子搭載HACを独立保持するクローンを4つ取得した。免疫染色法およびRT-PCR法にて初期化4因子の発現消失が認められ、かつ未分化マーカーの発現を認めた2クローンでOP9共培養法によるin vitro分化誘導を行い、RT-PCR法にて巨核球・血小板へ分化したサンプルのみでVIII因子の発現を確認した。本ベクターは巨核球・血小板特異的な発現を誘導するplatelet factor-4(PF4)プロモーターを用いていることから、in vitroにおいてではあるが、組織特異的にVIII因子の発現を誘導することを示した。一方、前年度に構築したVIII因子搭載マウス人工染色体(MAC)もまた同モデルマウス由来iPS細胞に導入して同様にクローンを8つ取得し、モデルマウスを用いたin vivoでの治療効果の検証のために使用可能なクローンを選定した。実際の治療効果の検証まではできなかったが、本年度までの研究でそのための資材を揃えることができた。