癌化抑制に関与する転写制御機構の解析

癌抑制遺伝子産物RBの標的である転写因子E2Fが、細胞増殖を促進する遺伝子と抑制する遺伝子を制御仕分ける機構の解析を行っている。これまでの研究でRBの機能不全によって生じた「制御を外れたE2F」は、RBの制御下で活性化された「生理的なE2F」が活性化しない癌抑制遺伝子を特異的に活性化することが分かっている。本研究では癌化抑制に重要なE2F1に注目して機能の異なるE2F1の生化学的違いを調べており、制御を外れたE2F1は生理的なE2F1よりも低リン酸化型である可能性が示唆された。本年度は、生理的なE2F1と制御を外れたE2F1で異なるリン酸化部位の同定を試みた。リン酸化を受け得る70か所のアミノ酸を各々リン酸化を受けないアミノ酸に置換したE2F1変異体を作成し、ウエスタンブロットにおける移動度で全てのE2F1変異体のリン酸化の程度を、レポーターアッセイで標的プロモーターの活性化能を、野生型E2F1と比較した。その結果、E2F1の転写活性化領域に存在するセリン375と403のリン酸化が、高リン酸化型のE2F1が生じるために必要であることが明らかになった。これは生理的なE2F1と制御を外れたE2F1の質的違いを示唆する初めての知見である。更にE2F1のリン酸化を行うものとしてCyc/CDKを予測し、CycD1/CDK4が生理的および制御を外れたE2F1活性に及ぼす影響を検討した。E2F1とCycD1/CDK4を共に過剰発現させると、E2F1単独で過剰発現させた時と比較して、制御を外れたE2Fで特異的に活性化されるARFプロモーターの活性化が抑制された。逆に、生理的なE2Fで活性化される増殖関連遺伝子Cdc6プロモーターの活性化は増強された。以上から、増殖刺激によって活性化されるCycDl/CDK4が生理的な高リン酸型E2F1を生み出すのに関与する可能性が示唆された。

癌抑制遺伝子産物RBの標的である転写因子E2Fが、細胞増殖を促進する遺伝子と抑制する遺伝子を制御仕分ける機構の解析を行っている。これまでの研究でRBの機能不全によって生じた「制御を外れたE2F」は、RBの制御下で活性化された「生理的なE2F」が活性化しない癌抑制遺伝子を特異的に活性化することが分かっている。本研究では癌化抑制に重要なE2F1に注目して機能の異なるE2F1の生化学的違いを調べており、制御を外れたE2F1は生理的なE2F1よりも低リン酸化型である可能性が示唆された。本年度は、生理的なE2F1と制御を外れたE2F1で異なるリン酸化部位の同定を試みた。リン酸化を受け得る70か所のアミノ酸を各々リン酸化を受けないアミノ酸に置換したE2F1変異体を作成し、ウエスタンブロットにおける移動度で全てのE2F1変異体のリン酸化の程度を、レポーターアッセイで標的プロモーターの活性化能を、野生型E2F1と比較した。その結果、E2F1の転写活性化領域に存在するセリン375と403のリン酸化が、高リン酸化型のE2F1が生じるために必要であることが明らかになった。これは生理的なE2F1と制御を外れたE2F1の質的違いを示唆する初めての知見である。更にE2F1のリン酸化を行うものとしてCyc/CDKを予測し、CycD1/CDK4が生理的および制御を外れたE2F1活性に及ぼす影響を検討した。E2F1とCycD1/CDK4を共に過剰発現させると、E2F1単独で過剰発現させた時と比較して、制御を外れたE2Fで特異的に活性化されるARFプロモーターの活性化が抑制された。逆に、生理的なE2Fで活性化される増殖関連遺伝子Cdc6プロモーターの活性化は増強された。以上から、増殖刺激によって活性化されるCycDl/CDK4が生理的な高リン酸型E2F1を生み出すのに関与する可能性が示唆された。