転写因子のタンパク質間相互作用ネットワークの解析

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本研究では、新しいタンパク質間相互作用スクリーニング法を用いて、植物のタンパク質リン酸化経路における転写因子のタンパク質間相互作用ネットワークの解明を目的とする。本年度は、蛍光タンパク質の構造補完をベースにした二分子蛍光補完(BiFC)法を用いたタンパク質間相互作用のスクリーニング法を植物で開発するため、変異型緑色蛍光タンパク質GFP-S65Tの改良を行った。BiFC法とは、蛍光タンパク質を中央付近で切断した二つの断片を、結合を調べたい二つのタンパク質にそれぞれ融合し、細胞内で蛍光タンパク質の構造の再構築を蛍光で検出するin vivo解析法である。GFP-S65Tタンパク質は、現在、広く利用されている緑色蛍光タンパク質であり、多くの研究装置がGFP-S65Tタンパク質に最適化されている。実際、本研究で利用する殆どの装置がGFP-S65Tを検出するのに適していた。しかし、本研究で利用するタンパク質間相互作用スクリーニング法のベースとなるBiFC法にGFP-S65Tタンパク質を供した場合、構造の再構築後に検出される蛍光の輝度が非常に低い問題があった。そこで、高感度なスクリーニング法を構築するため、GFP-S65Tタンパク質を用いたBiFC法の蛍光輝度を上昇させる変異を探索した。その結果、GFP-S65Tタンパク質に点変異V163Aを導入することによって、蛍光輝度が従来の7倍ほど上昇することを発見した。また点変異V163Aの導入は、GFP-S65Tタンパク質の蛍光スペクトルに影響を与えないこともわかった。これらの結果は、GFP-S65T/V163Aタンパク質を用いた高輝度緑色BiFC法がGFP-S65Tタンパク質に最適化された解析装置によって利用できることを示している。今後、これを用いた新しいスクリーニング法を開発する予定である。