Aキナーゼによる細胞運動制御機構の高浸潤性乳がん細胞を用いた解析

昨年度までの研究において、AキナーゼがWAVE2を介して細胞の仮足に局在し、仮足の形成を促進することで細胞運動を制御していることを明らかにしてきた。本年度はWAVE2と結合し、WAVE2とAキナーゼの複合体を安定化するタンパク質vinexinに着目し、実験を行った。Vinexinは細胞運動の制御において重要な役割を持つ細胞接着斑タンパク質vinculinと結合し、その機能を調節すると考えられている。そこで本年度は、vinexinがvinculinに与える影響、および、細胞内シグナルによるその制御メカニズムを解析し、Aキナーゼが細胞接着の制御を介してがん細胞の運動を活性化させる可能性を検証した。まず昨年度樹立を試みたタンパク質精製系を大きく改良し、生化学的実験に十分な質と量の精製タンパク質を得ることに成功した。これらを用いたin vitroアクチン共沈降実験から、vinexinが濃度依存的にvinculinとアクチン繊維の結合を促進することを明らかにした。免疫沈降実験の結果から、vinexinやvinculinがAキナーゼの直接の基質でないことが示唆されたため、Aキナーゼが間接的にビネキシンに影響を与える可能性が考えられた。そこで、がんの悪性化や細胞の運動に関与するERKやv-Srcといったキナーゼによるvinexinのリン酸化部位の変異体を作成し、これらの変異体をvinexin遺伝子破壊マウスより樹立したKO細胞に発現させ安定発現細胞を樹立した。これらの細胞を用いて、仮足の形成・進展や細胞-ECM接着の形成に与える影響を解析したが、どの変異体も野生型のビネキシンと有意差がなかった。以上の結果から、これらのシグナル伝達経路は単独では仮足の形成や細胞-ECM接着に影響を与えないことが示唆された。

昨年度までの研究において、AキナーゼがWAVE2を介して細胞の仮足に局在し、仮足の形成を促進することで細胞運動を制御していることを明らかにしてきた。本年度はWAVE2と結合し、WAVE2とAキナーゼの複合体を安定化するタンパク質vinexinに着目し、実験を行った。Vinexinは細胞運動の制御において重要な役割を持つ細胞接着斑タンパク質vinculinと結合し、その機能を調節すると考えられている。そこで本年度は、vinexinがvinculinに与える影響、および、細胞内シグナルによるその制御メカニズムを解析し、Aキナーゼが細胞接着の制御を介してがん細胞の運動を活性化させる可能性を検証した。まず昨年度樹立を試みたタンパク質精製系を大きく改良し、生化学的実験に十分な質と量の精製タンパク質を得ることに成功した。これらを用いたin vitroアクチン共沈降実験から、vinexinが濃度依存的にvinculinとアクチン繊維の結合を促進することを明らかにした。免疫沈降実験の結果から、vinexinやvinculinがAキナーゼの直接の基質でないことが示唆されたため、Aキナーゼが間接的にビネキシンに影響を与える可能性が考えられた。そこで、がんの悪性化や細胞の運動に関与するERKやv-Srcといったキナーゼによるvinexinのリン酸化部位の変異体を作成し、これらの変異体をvinexin遺伝子破壊マウスより樹立したKO細胞に発現させ安定発現細胞を樹立した。これらの細胞を用いて、仮足の形成・進展や細胞-ECM接着の形成に与える影響を解析したが、どの変異体も野生型のビネキシンと有意差がなかった。以上の結果から、これらのシグナル伝達経路は単独では仮足の形成や細胞-ECM接着に影響を与えないことが示唆された。