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CCN2/CTGFに結合するタンパク質の同定と機能解析

CCN2/CTGF 结合蛋白的鉴定和功能分析

基本信息

批准号：
10J04293
负责人：
星島光博
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

CCN2/CTGFは軟骨に強い発現を示し、軟骨細胞の増殖・分化や線維芽細胞や血管内皮細胞の接着・遊走など多彩な生理機能を発揮するが、一方で異所性の過剰な発現が種々の線維症や癌細胞で観察されることから、生体内では発現量やその活性は厳密にコントロールされていると思われる。昨年度までに我々は軟骨細胞様細胞株HCS-2/8より作製したcDNAライブラリーからCCN2と結合する因子として、CCNファミリーに属するCCN3とCCN2自身を同定した。また、これらの分子が結合し、アグリカンmRMの発現を制御している事を報告した。今年度は、さらにCCN2とCCN3間の結合の生理的意義を明らかにすることを目的とし、以下の結果を得た。1)アグリカンと同様に、HCS-2/8細胞においてH型コラーゲンmRNAレベルが、リコンビナントCCN2添加により上昇し、リコンビナントCCN3添加で低下すること、CCN3によるH型コラーゲンmRNAの発現抑制は、CCN2の濃度依存的に回復することを示した。2)HCS-2/8細胞における内在性のCCN2とCCN3が結合することを、それぞれの抗体を用いた免疫沈降により確認した。3)蛍光免疫染色により、内在性のCCN2とCCN3が細胞表面および細胞内で共局在していることを明らかにした。以上の結果より、CCN2は軟骨細胞において基質合成を促進する一方で、CCN3単独ではこれを抑制するが、CCN3はCCN2とヘテロダイマーを形成することで、軟骨細胞の基質産生を促進することが示された。このことはCCN2とCCN3が相互作用することで、互いの活性を厳密に調節し、生体内における軟骨組織の恒常性を維持している可能性を示唆している。さらに、CCN2の結合蛋白質の一つとして、細胞内の小胞輸送に関与する低分子量G蛋白質であるRab14 GTPaseを新たに同定した。CCN2とRab14が相互作用し、軟骨細胞においてプロテオグリカンを含む小胞の輸送に関与している可能性を示すデータを得ている。このことはCCN2がRab14のエフェクター分子として作用し、細胞内のシグナル伝達機構に関与することを示唆しており、軟骨細胞の機能を解明するための新たな知見である。

CCN2/CTGF has been shown to be active in cartilage development, chondrocyte proliferation, differentiation, vascular endothelial cell migration, and physiological function development. In 2005, the chondrocyte cell line HCS-2/8 was cloned into CCN-2 and CCN-3. CCN-2 and CCN-3 were cloned into the same cell line. This report is intended to address the issue of molecular binding and the development of a new type of RM. This year, the physiological significance of the combination between CCN2 and CCN3 is clear, and the following results are obtained 1) H-type mRNA expression in HCS-2/8 cells was inhibited by CCN2 addition, CCN3 addition, CCN3 inhibition, CCN2 concentration-dependent recovery. 2) The intrinsic binding of CCN2 and CCN3 in HCS-2/8 cells was confirmed by immunosedimentation using the available antibodies. 3) Immunostaining for CCN2 and CCN3 on the cell surface and in the cell. The above results show that CCN2 promotes matrix synthesis in chondrocytes, CCN3 inhibits matrix formation in chondrocytes and CCN2 promotes matrix formation in chondrocytes. The interaction between CCN2 and CCN3 is closely regulated, and the possibility of maintaining the homeostasis of cartilage tissue in vivo is indicated. In addition, CCN2 binding proteins are involved in intracellular cellular transport and low molecular weight G proteins are newly identified. CCN2 and Rab14 interact with each other, and chondrocytes are involved in the transport of chondrocytes. This new insight into the molecular role of CCN2 and Rab14 in understanding the function of chondrocytes and the mechanisms involved in their intracellular development.