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Hisタグ/Ni(II)－NTAペアによる細胞発現タンパク質のラベル化技術の開発

使用 His 标签/Ni(II)-NTA 对开发细胞表达蛋白标记技术

基本信息

批准号：
10J04346
负责人：
内之宮祥平
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J04346/
关键词：
タンパク質ラベル細胞内ラベル蛍光イメージングタンパク質間相互作用の解析 Hisタグ Ni-NTA ファルネシル化EGFP ラベル化タンパク質の拡張ラベル化プローブの拡張プロテアソーム分解タンパク質半減期測定細胞膜透過性キャリアーペプチド Oligo Arg配列 Oligo His配列

项目摘要

タンパク質に人工の機能性分子を特異的にラベル化する手法の開発は、タンパク質の機能解析に重要であるが、細胞内で目的タンパク質のラベル化と機能解析を行っている例は極めて少ない。申請者は、細胞内で標的タンパク質のラベル化と機能解析を目的としている。本研究では、オリゴヒスチジン(Hisタグ)と、ニトリロ三酢酸のNi錯体(Ni-NTA)間相互作用を利用した共有結合ラベル化法の開発を行っており、前年度までに細胞内での選択的ラベル化に成功した。本年度は、ラベル化タンパク質の機能解析を行った。まず、細胞内での蛍光イメージングを行った。標的としては細胞膜の内側に発現させたファルネシル化mcherry(mcherry-f)を選択し、タグ導入mcherry-fをA549細胞に強制発現させた。この細胞に、蛍光色素であるフルオレセインを有するNi-NTAを導入したところ、細胞膜の内側からフルオレセインの蛍光が見られr、mcherry-fの蛍光局在と良く一致した。また、タグの無いmcherrry-fの場合は同様の蛍光は見られなかったことから、細胞内でタグ導入タンパク質のイメージングに成功した。次に、タンパク質間相互作用を光クロスリンクによって検出した。光クロスリンクでは、光反応基をタンパク質に導入し、UVを照射することで相互作用している2つのタンパク質を共有結合で架橋する(光架橋)。この光架橋での分子量変化をウエスタンブロッティングによって解析した。ラバマイシン存在下でFKBP12と相互作用するFRBにタグを導入し、光反応基としてジアジリンをラベル化した。次に、ラバマイシンを添加した後、UV照射した。結果、UV照射、ラバマイシン存在下でのみ、FKBP12とFRBの複合体と思われる分子量にバンドが確認された。以上より、本研究によって細胞内で特定タンパク質選択的ラベル化と機能解析に成功した。

The development of artificial functional molecules is very important for the functional analysis of natural substances, and the development of intracellular functional molecules is very important for the functional analysis of natural substances The applicant shall, in accordance with the requirements of the intracellular standard, analyze the quality and function of the target. In this study, the interaction between Ni complex and triacetic acid (Ni-NTA) was successfully developed by using the co-binding reaction method. This year, we will carry out the functional analysis of the quality of the products. In the cell, there is no light source. The target cell membrane was transformed into mcherry(mcherry-f) and the stress was induced into A549 cells. The cell, the pigment, the Ni-NTA, the cell membrane, the inner part of the cell membrane, the pigment, the Ni-NTA, the Ni-NTA. In the same way, in the same way, in the same way, The second phase is the mass-to-mass interaction. Light bridge, light bridge. The molecular weight of the light bridge is changed. In the presence of RABAMISHIN, FKBP12 and FRB interactions are introduced, and the optical reflection basis and technology are integrated. Next, after the addition of UV irradiation The results showed that the molecular weight of FKBP12 and FRB complexes was significantly higher than that of FKBP12 and FRB complexes in the presence of UV irradiation and RP-irradiation. In this study, we succeeded in analyzing the function of the cell specific protein.