Hisタグ/Ni(II)－NTAペアによる細胞発現タンパク質のラベル化技術の開発

使用 His 标签/Ni(II)-NTA 对开发细胞表达蛋白标记技术

基本信息

批准号：
10J04346
负责人：
内之宮祥平
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J04346/
关键词：
タンパク質ラベル細胞内ラベル蛍光イメージングタンパク質間相互作用の解析 Hisタグ Ni-NTA ファルネシル化EGFP ラベル化タンパク質の拡張ラベル化プローブの拡張プロテアソーム分解タンパク質半減期測定細胞膜透過性キャリアーペプチド Oligo Arg配列 Oligo His配列

项目摘要

タンパク質に人工の機能性分子を特異的にラベル化する手法の開発は、タンパク質の機能解析に重要であるが、細胞内で目的タンパク質のラベル化と機能解析を行っている例は極めて少ない。申請者は、細胞内で標的タンパク質のラベル化と機能解析を目的としている。本研究では、オリゴヒスチジン(Hisタグ)と、ニトリロ三酢酸のNi錯体(Ni-NTA)間相互作用を利用した共有結合ラベル化法の開発を行っており、前年度までに細胞内での選択的ラベル化に成功した。本年度は、ラベル化タンパク質の機能解析を行った。まず、細胞内での蛍光イメージングを行った。標的としては細胞膜の内側に発現させたファルネシル化mcherry(mcherry-f)を選択し、タグ導入mcherry-fをA549細胞に強制発現させた。この細胞に、蛍光色素であるフルオレセインを有するNi-NTAを導入したところ、細胞膜の内側からフルオレセインの蛍光が見られr、mcherry-fの蛍光局在と良く一致した。また、タグの無いmcherrry-fの場合は同様の蛍光は見られなかったことから、細胞内でタグ導入タンパク質のイメージングに成功した。次に、タンパク質間相互作用を光クロスリンクによって検出した。光クロスリンクでは、光反応基をタンパク質に導入し、UVを照射することで相互作用している2つのタンパク質を共有結合で架橋する(光架橋)。この光架橋での分子量変化をウエスタンブロッティングによって解析した。ラバマイシン存在下でFKBP12と相互作用するFRBにタグを導入し、光反応基としてジアジリンをラベル化した。次に、ラバマイシンを添加した後、UV照射した。結果、UV照射、ラバマイシン存在下でのみ、FKBP12とFRBの複合体と思われる分子量にバンドが確認された。以上より、本研究によって細胞内で特定タンパク質選択的ラベル化と機能解析に成功した。

在蛋白质上特异性标记人工功能分子的方法的开发对于蛋白质的功能分析很重要，但是在很少有情况下，靶蛋白在细胞中标记并在功能上进行了功能分析。申请人旨在标记和功能分析细胞内靶蛋白。在这项研究中，我们开发了一种共价标记方法，该方法利用了硝基三环酸的寡聚碱（他的标签）和Ni复合物（Ni-NTA）之间的相互作用，到了上一年，选择性标记成功。今年，进行了标记蛋白的功能分析。首先，进行细胞内荧光成像。作为靶标，选择了在细胞膜内表达的Farnesylated Mcherry（MCHERRY-F），并将标记为MCHERRY-F被迫在A549细胞中表达。当将具有荧光染料荧光素的Ni-NTA引入这些细胞时，从细胞膜内观察到荧光素荧光素，并且与R和MCHERRY-F的荧光定位非常一致。此外，在没有标签的情况下，在MCHERRRY-F的情况下未观察到相似的荧光，因此，标记蛋白的成像成功地细胞内进行。然后通过光叠链链接检测蛋白质相互作用。在光叠链链接中，将光反应基团引入蛋白质中，并通过用紫外线（PhotoCropoSlinking）辐射通过辐射共价交联。通过蛋白质印迹分析了这种光链接过程中分子量的变化。在薰衣草素存在下，将标签引入了与FKBP12相互作用的FRB中，并将重氮嗪标记为光反应组。接下来，添加熔岩霉素，然后进行紫外线照射。结果，只有在紫外线辐照和薰衣草素的存在下，在分子量上证实条带似乎是FKBP12和FRB的复合物。基于上述，这项研究已成功地对细胞中特定蛋白质进行了选择性标记和功能分析。