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レプリソーム形成と安定化機構の解明

阐明复制体的形成和稳定机制

基本信息

批准号：
10J04745
负责人：
菅家舞
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J04745/
关键词：
DNA複製 AID法 Mcm10 zinc finger Mcm2-7 RPA CMG複合体分裂酵母

项目摘要

細胞が増殖するためには遺伝情報を担うDNAを正確に複製する必要がある。DNA複製は、DNAヘリカーゼであるMCM複合体の複製開始点結合と活性化を経て開始する。MCMは、開始点にロードされるときは二重鎖DNAにdouble hexamerとして結合するが、活性化後はsingle hexamerが一本鎖DNAに結合していると考えられている。しかし、どのようにしてその変化が起こるのかはよく分かっていない。MCMの活性化段階では、GINS、Cdc45などの因子がMCMに集合することが必要である。複製フォークにおいてMCMはGINS、Cdc45と強固な複合体(CMG複合体)を形成しており、これがヘリカーゼの核であると考えられている。複製フォークにおいてGINS,Cdc45はMcm2-7とCMG複合体(Cdc45-Mcm2-7-GINS)を形成しており,これがヘリカーゼの核であると考えられている。Mcm10は真核生物で保存された因子であり、複製開始に必要であること、また複製フォークにも局在することから、Mcm10の機能を理解することでMCMヘリカーゼの活性化メカニズムを知ることが出来るのではないかと考えた。私は条件誘導的蛋白質分解法(AID法)を分裂酵母で開発・構築し(Kanke et al.,2011)、この方法を用いてMcm10を細胞から除去して解析を行った。その結果、Mcm10がなくても複製開始点上にCMG構成因子が集合することを見出した。このとき、一本鎖DNAに結合するRPAやDNA Pol α,δの複製開始点結合は大幅に減少していたことから,開始点DNAの二重鎖開裂は起こっていないと考えられる。興味深いことに、Mcm10除去条件で,保存されたzinc fingerモチーフにアミノ酸置換を導入した変異Mcm10蛋白を発現させると、この蛋白は複製開始点に結合するがRPAの結合は誘起されなかった。さらにこの変異によりMcm10同士のself-interactionと一本鎖DNA結合活性が低下していた。私は,Mcm10がmultimerとしてCMG複合体に結合してその構造をdouble hexamerからsingle hexamerへと変化させ,さらに一本鎖結合活性によって開始点の開裂を安定化することにより,DNA複製開始に必須の役割を果たしているのではないかと考えている(Kanke et al.,2012)。

Cell DNA replication is essential DNA replication, DNA replication, MCM complex replication start point binding, activation start point MCM is a double-locked DNA molecule that binds to a starting point and a single-locked DNA molecule that binds to a starting point. It's not like you're going to be able to change your mind. MCM activation stage is necessary for the aggregation of factors such as GINS, Cdc45, etc. The CMG complex (CMG complex) was formed by the formation of MCM GINS and Cdc45. The complex Cdc45-Mcm2-7 CMG complex (Cdc45-Mcm2 -7-GINS) was formed in the form of Cdc45-Mcm2 -7 CMG complex. Mcm10 is a eukaryote with a preservation factor that is necessary for replication. The development and construction of yeast fission by the AID method (Kanke et al., 2011)This method is applied to Mcm10 cells. As a result, Mcm10 can be seen on the CMG component set at the copy start point. DNA binding at the start point of replication is greatly reduced, and DNA cleavage at the start point of replication is greatly reduced. In addition, Mcm10 removal conditions, preservation of zinc finger, introduction of acid replacement, development of different Mcm10 proteins, and binding of protein to replication initiation sites are also discussed. The self-interaction and DNA binding activity of Mcm10 were decreased. Mcm10 is a multiple molecule that binds to CMG complexes, and its structure is a double hexamer, a single hexamer, and a single lock binding activity. The initiation point of cleavage is stabilized, and DNA replication begins with the necessary cleavage process (Kanke et al., 2012)。