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新規細胞内分子進化法の創成及び人工shRNAスイッチによる細胞運命制御系の構築

利用人工shRNA开关创建新型细胞内分子进化方法并构建细胞命运控制系统

基本信息

批准号：
10J06449
负责人：
樫田俊一
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、培養細胞とセルソーターを用いた新規の人工分子進化法を創出し、細胞内環境で特定の蛋白質に応答して、標的遺伝子の発現を制御する活性をもつshRNA(short hairpin RNA)を取得することである。そして、取得したshRNAを用いて、細胞内遺伝子発現の状態に応答して細胞運命を制御するシステムを構築することである。前年度までの研究の結果、上半期に細胞内遺伝子発現の状態に応答してアポトーシス制御シグナルを改変できる、細胞運命制御システムを構築することに成功し、ガン細胞特異的な除去システム等の基盤技術を確立できた。しかし、細胞内分子進化法の構築が難航したため、計画を変更し、shRNAのループに既存のRNA-蛋白質結合モチーフから抽出した天然由来の蛋白質結合RNA配列、または蛋白質結合RNAアプタマーを組み込み、これらの結合蛋白質に応答するshRNAスイッチを、分子進化法ではなく、立体構造を考慮してコンピュータ上で設計する手法の開発に着手した。具体的には、まず、RNA-蛋白質結合の共結晶構造に様々な長さの2重鎖部位を結合して、shRNAスイッチに結合蛋白質がつながった複合体の3次元コンピュータモデルを構築した。3次元モデルから、shRNAの2重鎖の長さを変えることで、ループ部位と結合蛋白質は、2重鎖部位を中心に螺旋階段を上るように、1塩基あたり、30度回転すると予想された。その後に、鞭毛虫の一種であるGiardiaのDicerの結晶構造を上述の複合体と切断活性部位を基準に重ね合わせ、3次元モデル上でDicerと結合蛋白質が立体障害を起こすかどうかを検討した。この結合蛋白質がDicerと立体障害を起こせば、Dicerが蛋白質の結合したshRNAに結合、切断することが出来なくなり、結合蛋白質依存的なshRNA切断スイッチになると考えられるからである。そのうえで、設計したshRNAと結合蛋白質との特異的結合が、3次元モデルで想定された立体障害に応じて、Dicerの切断を阻害するかを試験管内の再構成系で確認し、さらに細胞内で結合蛋白質の発現に応答するshRNAスイッチとしての機能を持つか検証した。その結果、この立体障害に相関して、スイッチのON/OFF効率が上昇することが判明し、3次元モデルを元にしたRNAスイッチの創成に成功し、新たな機能性RNAの設計手法を確立した。また、その手法を用いて、新たにヒトの免疫疾患に関わる蛋白質であるU1A蛋白質、ガン細胞で過剰発現するNFκB蛋白質、それぞれに応答してノックダウン機能を制御可能なshRNAスイッチを得た。今年度の研究成果は、元の研究計画に基づくものではないが、3次元構造をもとに機能性の遺伝子制御システムを設計する新手法の独創性と将来性が評価され、当該分野Synthetic Biologyで最大の国際学会であるthe 5th International Meeting on Synthetic Biologyに招待され、講演を行った。また、この研究成果を論文としてNucleic Acids Research誌に投稿し、現在査読中である。

The purpose of this study is to develop new methods of molecular evolution for cell culture and to obtain the activity of shRNA(short hairpin RNA) for controlling the expression of specific proteins in intracellular environment. The expression of shRNA in cells was determined by DNA sequencing. The results of the previous year's research, the first half of the study, the improvement of the status of intracellular gene production, the construction of cell cycle control systems, the success of cell-specific gene removal systems, etc., were established. The construction of intracellular molecular evolution method is difficult to navigate, the planning is changed, the existing RNA-protein binding mechanism is extracted, the naturally derived protein-binding RNA is arranged, the protein-binding RNA is assembled, the shRNA binding mechanism is changed, the molecular evolution method is changed, the three-dimensional structure is considered, and the design method is started. Specific RNA, RNA and protein binding co-crystal structure, long 2-fold lock site binding, shRNA and protein binding complex 3-dimensional structure 3-D shRNA, 2-D shRNA, 3-D shRNA, 3-D shRNA The crystal structure of Giardia Dicer, a kind of flagellates, is discussed in this paper. The binding protein Dicer steric barrier arises, Dicer protein binding shRNA binding, cleavage, binding protein dependent shRNA cleavage. The specific binding of shRNA binding proteins to the cells was designed to determine the three-dimensional binding mechanism and the function of shRNA binding proteins in vitro was confirmed by the reconstitution system in vitro. As a result, the three-dimensional damage correlation, the ON/OFF efficiency of the RNA increased, and the success of the three-dimensional RNA design was established. shRNA is used to control the function of U1A protein, NFκB protein, and other proteins involved in immune diseases. This year's research results include an evaluation of the originality and futurity of new approaches to the design of functional genetic systems for three-dimensional structures, and a presentation at the 5th International Meeting on Synthetic Biology, the largest international society in the field of Synthetic Biology. The results of this research are published in Nucleic Acids Research.

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

3D Molecular Design and Construction of Protein-Responsive shRNA Systems

蛋白质响应 shRNA 系统的 3D 分子设计和构建

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
Saito Hirohide;Fujita Yoshihiko;Kashida Shunnichi;Hayashi Karin;Inoue Tan;Shunnichi Kashida;Shunnichi Kashida;樫田俊一;樫田俊一;Shunnichi Kashida
通讯作者：
Shunnichi Kashida

RNP相互作用を用いたタンパク質応答型翻訳制御スイッチの構築

利用 RNP 相互作用构建蛋白质响应翻译控制开关

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
Saito Hirohide;Fujita Yoshihiko;Kashida Shunnichi;Hayashi Karin;Inoue Tan;Shunnichi Kashida;Shunnichi Kashida;樫田俊一;樫田俊一
通讯作者：
樫田俊一

New short hairpin RNA useful in system for controlling RNA inter ference, comprises guide strand, passenger strand and linker strand

用于控制RNA干扰系统的新型短发夹RNA，包含引导链、过客链和连接链

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

蛋白質応答型人工RNAスイッチによる細胞運命制御細胞内診断型RNA医薬の実現を目指して

旨在利用蛋白质响应性人工RNA开关实现控制细胞命运的细胞内诊断RNA药物

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
0
作者：
Saito Hirohide;Fujita Yoshihiko;Kashida Shunnichi;Hayashi Karin;Inoue Tan;Shunnichi Kashida;Shunnichi Kashida;樫田俊一
通讯作者：
樫田俊一

Synthetic human cell fate regulation by protein-driven RNA switches.