Investigation of structure and function of the COPI-System using single, on nanostructures immobilised molecules and fluorescence resonance energy transfer (FRET)

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Ziel der interdisziplinären Projektinitiative ist die Aufklärung der Struktur-Funktions-Zusammenhänge einer Bio-Molekularen Maschine am Beispiel des Transportvesikels COPI. Das COPI-System ist ideal für die geplanten Untersuchungen geeignet, da sich das Coatomer für eine spezifische Markierung mit Donor- und Akzeptorfarbstoffen biochemisch in seine 7 Untereinheiten zerlegen und reversibel wieder zu einem funktionierenden Coatomer zusammenbauen läßt. Während der prinzipielle Mechanismus der COPI-Vesikel-Abschnürung im Detail aufgeklärt wurde, ist wenig zur Architektur und Dynamik der Struktur des Coatomers sowie zum Transportweg abgeschnürter Vesikel und dessen Steuerung in vivo bekannt. Zur Strukturaufklärung soll im beantragten Projekt der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) auf Einzelmolekülebene (single-pair, spFRET) eingesetzt werden. Hierzu sollen verschiedene Kombinationen von Untereinheiten des Coatomer-Komplexes gezielt mit Farbstoffen markiert und aufgrund der bestimmten Donor/Akzeptor-Abstände ein 3D-Model des Coaotomer erstellt werden. Die Dynamik der intramolekularen Abstände und deren Veränderung bei Anbindung von Rezeptoren soll durch Experimente an einzelnen Coatomer-Molekülen, die auf einer Nanostruktur fixiert sind, mit einer Zeitauflösung im µs-ms Bereich aufgeklärt werden. Es soll die Richtungssteuerung durch das zeitaufgelöste Fluoreszenz-Imaging einzelner farbstoff- oder GFP-markierter COPI-Vesikel bzw. Coatomere in lebenden Zellen studiert und verstanden werden.