Molecular interactions of a receptor/transducer complex during photosignaling studied with single molecule fluorescence spectroscopy

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Das Ziel des beantragten Projektes ist es, elementare Schritte im Licht-sensitiven Rezeptor/Transducer-Komplex aus dem Organismus N. Pharaonis (NpSRII/NpHtrII - Komplex) während der Signalübertragung zu studieren. Dieser Komplex ist in der Plasmamembran des Organismus verankert und dient diesem, optimale Lichtbedingungen zu finden (Phototaxis). Der Rezeptor gehört zur Familie der "sieben Helix"- Proteine, die über eine an das Protein gebundene Chromophore durch Licht aktiviert werden. Der Tansducer besteht aus zwei trans-Membran Helices und einer cytoplasmatischen Domäne, welche mit einer Länge von circa 200 Å in das Cytoplasma hinein ragt. Der Rezeptor reagiert nach Lichtaktivierung mit einer nach außen gerichteten Verkippung der F-Helix während des Photozyklus. Dieses Signal wird anschließend an den Transducer weitergeleitet, der daraufhin ebenfalls mit einer Konformationsänderung reagiert. Diese Kaskade von Konformationsänderungen, die sich innerhalb des Transducers bis in den cytoplasmatischen Teil der Struktur fortsetzt, aktiviert schließlich cytoplasmatische Proteine der sogenannten "Zwei-Komponenten"-Signalübertragungskaskade. Wir wollen dieses System mit zeitaufgelöster Fluoreszenz-Spektroskopie auf Einzelmolekülniveau untersuchen. Bei dieser Technik werden extrem empfindliche Fluorophore an spezifische Stellen im Protein gebunden, die dort als "Sonden" genutzt werden. Diese Sonden sollen Informationen über Konformationsänderungen in einzelnen Proteinen und über Änderung in der Molekülanordnung zwischen Rezeptor und Transducer liefern. Der durch Licht der Wellenlänge von etwa 500 nm aktivierte Arbeitszyklus des Photorezeptors kann bei dieser Technik über die Messung einiger Fluoreszenzparameter (z.B. Fluoreszenzanisotropie, Fluoreszenzlebensdauer, FRET, FCS) verfolgt und charakterisiert werden. Das zentrale Ziel unserer Studien ist es, die Konformationsänderungen im Transducer zu vermessen und den präzisen zeitlichen Ablauf der Übertragungsschritte im Komplex zu bestimmen. Diese Kenntnisse sind für ein genaues Verständnis der Kopplung aufeinanderfolgender Schritte essentiell. In weiteren Antragsperioden soll die gesamte Kaskade der Signalübertragung sowie die Interaktion zwischen den beteiligten Proteinen untersucht werden.