Die Replikationsgabel-Barriere im rDNA-Locus der Maus als Kontra-Helikase

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Ziel des Projektes ist, den Wirkmechanismus der Replikationsgabelbarriere (RFB) im rDNA-Locus des Maus-Genoms aufzuklären. Es soll im Rahmen dieses Projektes analysiert werden, ob Wirtszell-Helikasen durch TTFI orientierungsspezifisch inhibiert werden. Deshalb sollen Untersuchungen mit einem murinen MCM4,6,7-Komplex durchgeführt werden, da diesem Helikaseaktivität zugeschrieben wird, eine Aktivität, die wir in eigenen Vorversuchen bestätigen konnten. Hierfür sollen die drei MCM-Proteine in Insektenzellen koexprimiert, der Komplex gereinigt und dessen Helikaseaktivität enzymologisch analysiert werden. Der Einfluss von Einzelstrang-Bindungsproteinen auf die Helikaseaktivität des MCM-Komplexes und auf die Kontrahelikaseaktivität der RFB soll untersucht werden. Außerdem beabsichtigen wir, diejenigen Proteindomänen von TTFI zu bestimmen, die für die Kontrahelikaseaktivität essentiell sind. Es soll untersucht werden, ob und wenn ja wodurch eine GC-reiche DNA-Sequenz, die benachbart zur TTFI-Bindungssequenz liegt, die Kontrahelikaseaktivität beeinflusst. Um die molekulare Wirkungsweise von TTFI als Kontrahelikase und RFB-Konstituente verstehen zu lernen, soll untersucht werden, welche zellulären Replikationsproteine mit TTFI interagieren und welche Proteindomänen von TTFI für diese Wechselwirkungen essentiell sind. Ein weiteres Ziel ist die Anwendung eines Systems zur stabilen konditionalen Expression von siRNA, um Effekte eines Protein-Knock-down von TTFI auf das Ausmaß von Replikation und Replikationstermination in vivo untersuchen zu können.