Analyse der spatialen und temporalen Interaktionen des murinen ORC-Komplexes

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Unser langfristiges Ziel ist es, die Rolle des murinen "origin recognition complex" (ORC) bei der Replikationsinitiation aufzuklären. Folgende Aspekte sollen bearbeitet werden: 1) Mit genetischen und biochemischen Verfahren sollen Protein-ProteinInteraktionen im ORC-Komplex von einzelnen ORC-Untereinheiten miteinander und von diesen ORC-Proteinen mit anderen Replikationsproteinen in vitro und in vivo untersucht werden. (2) Protein-Protein-Interaktionen am ORC und im gesamten präreplikativen Komplex sollen mit der Methode des Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfers (LRET) sowohl in vitro, also auch in lebenden Zellen in "real time" gemessen werden. (3) Sequenzspezifische ORC-Orgin-DNA-Interaktionen sollen durch Gelretardation, Immunpräzipitation sowie CHIP- und Footprint-Analyse aufgeklärt werden. (4) Es sollen alle sechs rekombinanten ORCUntereinheitsproteine gemeinsam in Insektenzellen exprimiert, der hexamere Komplex nativ rekonstituiert, gereinigt und analysiert werden. Wir erwarten, daß diese Untersuchungen zur Erarbeitung einer weitgehend vollständigen spatialen und temporären "Assembly-Map" des gesamten präreplikativen Komplexes führen werden und darüberhinaus wichtige Einblicke in biologische Funktion der ORC-Untereinheiten und ORC-assoziierten Initiatorproteine erlauben.