ヒトES及びiPS由来心筋細胞の電気的な成熟過程とその分子機構の解明

阐明人ES和iPS来源的心肌细胞的电成熟过程及其分子机制

• 批准号: 22790731
• 负责人: 遠山 周吾
• 金额: $ 2.25万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22790731/
• 关键词: ES細胞; iPS細胞; ヒト; イオンチャネル; 成熟化; 心筋細胞; 活動電位

【目的】ヒトES及びiPS由来心筋細胞において培養期間・条件によってどの種類の心筋細胞が出現し、どのように成熟化していくのか電気生理学的4種の手法を駆使して詳細に解析する。さらに、その分子機構に迫り、表現型との両面から多様な心筋細胞の発生分化を理解する。【方法】培養早期(30日未満)と後期(60日以降)におけるヒトEs及びiPS由来心筋細胞の活動電位変化を解析する。ヒトES及びiPS由来心筋細胞を培養時期に応じて精製し、多様性の変化を4種の電気生理学的手法で評価する。培養時期に応じた精製心筋細胞のイオンチャネルの遺伝子・蛋白発現量変化やそれらをコントロールする上流の遺伝子候補を探索する。【結果】まずヒトES及びiPS由来心筋細胞における様々なタイプの活動電位波形(結節型・心房型・心室型)を微小電極法により解析することに成功した。さらに培養早期から後期にかけての活動電位波形パターンを解析することで結節型、すなわちペースメーカ細胞の割合が減少し、心室筋細胞が増加することを見出した。さらにヒトES及びiPS由来の胚様体からミトコンドリア高発現分画をFACSを用いて抽出する(Hattori F Nature Methods 2011)ことで培養時期に応じたヒトES及びiPS由来精製心筋細胞を抽出した。培養時期に応じた精製後ヒトES及びiPS由来心筋細胞のチャネル電流の量的機能的解析を行うため、パッチクランプ法によって経時的変化を評価したところ、やはりペースメーカー電流が培養時期に応じて減少傾向にあることを確認した。また、さらにイオンチャネルにおける遺伝子発現量の変化をQT-PCRにより評価したところ、HCNチャネルは低下傾向にあることを確認した。今後、他のイオンチャネルに関する発現量の変化を解析し、さらにそれらをコントロールする上流の遺伝子候補を探索していく。

[Objective] To analyze in detail the four methods of ES and iPS derived from cardiac muscle cells, including culture period, culture condition, maturation and electrophysiology. To understand the molecular mechanisms, phenotypes, and differentiation of multiple cardiac muscle cells. [Methods] The changes in activity potential of cardiac muscle cells were analyzed during the early (30th day) and late (60th day) stages of culture. ES and iPS were evaluated by four electrophysiological methods for purification and diversification of cardiac muscle cells during culture Culture period: Purified muscle cells, protein production, protein production [Results] The activity potential waveforms of ES and iPS derived from cardiac muscle cells (nodular type, cardiac chamber type and ventricular type) were analyzed successfully by microelectrode method. In the early stage of culture, the activity potential waveform was analyzed. The results showed that the number of nodular cells decreased and the number of ventricular muscle cells increased. The ES and iPS derived embryos were isolated by FACS (Hattori F Nature Methods 2011). The ES and iPS derived cells were isolated by culture. The analysis of the function of ES and iPS derived from the culture of muscle cells during the culture period was carried out. The change of gene expression was confirmed by QT-PCR. In the future, the number of changes related to the production of other products will be analyzed, and the number of upstream products will be explored.