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リン酸化プロテオミクスによるmTORの細胞機能の解明

通过磷酸蛋白质组学阐明 mTOR 的细胞功能

基本信息

批准号：
11J10890
负责人：
大根陽一郎
金额：
$ 1.02万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J10890/
关键词：
リン酸化シグナル伝達 Phospho-Flow Phospho-flow

项目摘要

採用期間中、研究代表者は海外渡航先であるBaylor Institute for Immunology Research (以下BIIR)にて細胞内のリン酸化をハイスループットに解析する手法を検討した。細胞内のシグナル伝達因子のリン酸化をリン酸化特異的抗体とフローサイトメトリーを組み合わせて検出する方法(Phospho-flow)がスタンフォード大学のGary Nolan博士らにより開発されている。この手法は従来のwestern blot法に比べ以下のような利点を有している。すなわち、1.細胞を溶解する必要が無いため解析に要する時間が短い2.検出に蛍光を用いるため定量性に優れる3.各種細胞マーカーの染色と組み合わせることにより、ヘテロな細胞集団においても細胞特異的なリン酸化を検出できることである。また、Nolan博士のグループはPhospho-flow法をよりハイスループットにするためFluorescent cell barcoding (FCB)法を開発した。この方法では細胞を異なる種類/濃度のアミノ基反応型蛍光色素によりバーコード化することで、異なる実験群の細胞を同一チューブ内で染色・データの取得を行えるようにしたものである。私はFCB法を96穴プレート上で効率良く行うプラットフォームを開発し、また、新たなバーコード色素を検討することで、理論上1000を超える条件の実験群の同時検出が可能にした。BIIRでは生体内の樹状細胞に対して特定のペプチドをデリバリーするためのシステムとして、樹状細胞に特異的に発現するレセプター分子に対する特異的な抗体を作成し、これにペプチドを結合させるというシステムを開発していた。これらの検討の中で、ある種の抗体がレセプターに対してアゴニスティックに働くことが示唆されていた。私は12種類のアゴニスト抗体と各5点の刺激時間の合計60の実験群に対し、50種のシグナル伝達因子のリン酸化を解析したが、上記の方法により、わずか半日でデータを取得することができた。各種アゴニスト抗体は異なるシグナル伝達のプロファイルを示すことがわかり、これらの抗体の特徴づけに大きく寄与することができた。

The Baylor Institute for Immunology Research (BIIR), a representative of the Chinese Academy of Sciences, was used to investigate intracellular acidification. Phospho-flow is a method for the detection of intracellular protein expression factors and the development of specific antibodies and protein expression factors by Dr. Gary Nolan of the University of Chicago. The western blot method is more effective than the western blot method. 1. Cell lysis is necessary; 2. Detection is quantitative; 3. Detection is specific. The Fluorescent cell barcoding (FCB) method was developed. The method is to obtain the dye from cells of different types/concentrations. The FCB method is effective in 96-point detection, and new pigment detection conditions are theoretically 1000-point detection and simultaneous detection. BIIR produces antibodies specific to dendritic cells in vivo that bind to specific molecules. This is the first time I've ever seen an antibody that's been tested. The total stimulation time of 12 kinds of antibodies and 5 points of each antibody was 60. The analysis of the stimulation time of 50 kinds of antibodies was carried out by the method mentioned above. All kinds of antibodies are different, and the characteristics of antibodies are different.