哺乳細胞内の機能的タンパク質複合体を対象としたin－cell NMR法の開発

针对哺乳动物细胞中功能蛋白复合物的细胞内核磁共振方法的开发

• 批准号: 11J11066
• 负责人: 久保 智史
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J11066/
• 关键词: In-cell NMR; CLIP-170; 微小管; TCS; TCS法

本研究では昨年度までに、NMRサンプル管内に培地を潅流するバイオリアクターを開発し、細胞内に導入した安定同位体標識タンパク質の相互作用を観測するNMR法であるin-cell TCS実験によって、CG1の微小管結合界面上に存在する残基であるL77, I90, L92, V103, I117において、相互作用を反映する顕著なNMRシグナル強度減少を観測した。本年度は、観測された相互作用が内在性微小管との特異的な相互作用に由来することを確かめるため、過剰量の非標識CG1を細胞内に導入することによるCG1-微小管間相互作用の阻害実験を行った。そこで、安定同位体標識CG1に加えその10倍量の非標識CG1を細胞内に導入して、in-cellNMR測定を行った。まず、10倍量の非標識CGl存在下において細胞内におけるCG1と微小管の相互作用が阻害されているかどうかを調べるため、本実験条件下における細胞内CG1の化学シフト値を調べた。その結果、10倍量の非標識CGIを導入することで、内在性微小管との特異的な相互作用を反映する化学シフト変化が抑制され、細胞内におけるCGI-微小管間相互作用が阻害されていることが示された。次に、10倍量の非標識CGI存在下において、HeLa細胞内における安定同位体標識CG1のin-cell TCS実験を行った。その結果、CGIのL77, I90, L92, V103, I117におけるシグナル強度減少は顕著に減弱し、CG1全残基におけるシグナル強度減少率は0.5以下に抑制された。よって、in-cell TCS実験において観測されたシグナル強度減少は、細胞内における微小管との相互作用界面を反映しており、in-cell TCS法によって細胞内に導入したタンパク質と内在性タンパク質との相互作用を観測することに成功したと結論した。TCS法は膜タンパク質などの巨大分子との相互作用解析に実績がある手法であるため、今後in_cell TCS法によって細胞内の膜タンパク質との相互作用を解析できると考える。

In this study, as of last year, we developed a bioreactor that perfuses medium into NMR sample tubes, and by in-cell TCS experiments, an NMR method that observes interactions of stable isotope-labeled proteins introduced into cells, we observed a significant decrease in NMR signal intensity that reflects interactions in L77, I90, L92, V103, and I117, which are residues present on CG1的微管结合界面。在今年，我们通过将过量的未标记CG1引入细胞中，以确认观察到的相互作用源于与内源性微管的特定相互作用。因此，除了稳定的同位素标记的CG1外，还引入了未标记的CG1量的10倍，并进行了细胞内NMR测量。首先，为了研究在未标记的CGL量的10倍的情况下，是否会抑制CG1与微管之间的相互作用，研究了本实验条件下细胞内CG1的化学位移值。结果表明，引入未标记的CGI抑制的10倍化学位移变化，反映了与内源微管的特定相互作用，并抑制了细胞内的CGI-微管相互作用。接下来，在存在10倍未标记的CGI的情况下，进行了HeLa细胞中稳定的同位素标记CG1的细胞内TCS实验。结果，CGI的L77，I90，L92，V103和I117的信号强度降低显着降低，并且所有CG1残基的信号强度降低速率均抑制低于0.5。因此，得出结论，在细胞内TCS实验中观察到的信号强度的降低反映了细胞中微管之间的相互作用界面，并且在观察引入细胞中引入的蛋白质之间的相互作用方面，细胞内的TCS方法成功了。由于TCS方法在分析与大分子（例如膜蛋白）的相互作用方面具有良好的记录，因此我们认为IN_CELL TCS方法可以分析未来与细胞中膜蛋白的相互作用。

项目成果

An NMR method to observe protein・protein interactions in living mammalian cells using the gel encapsulated bioreactor system

使用凝胶封装生物反应器系统观察活哺乳动物细胞中蛋白质与蛋白质相互作用的 NMR 方法

• 发表时间: 2012
• 作者: Satoshi Kubo;Noritaka Nishida;Yuko Udagawa;Osamu Takarada;Shinji Ogino;Ichio Shimada;久保 智史
• 通讯作者: 久保 智史

A Gel-Encapsulated Bioreactor System for NMR Studies of Protein-Protein Interactions in Living Mammalian Cells

• DOI: 10.1002/anie.201207243
• 发表时间: 2013-01-01
• 期刊: ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION
• 影响因子: 16.6
• 作者: Kubo, Satoshi;Nishida, Noritaka;Shimada, Ichio
• 通讯作者: Shimada, Ichio

哺乳細胞内でタンパク質相互作用界面を決定するための新規in-cell NMR測定手法の開発

开发一种新型细胞内核磁共振测量方法来确定哺乳动物细胞中的蛋白质相互作用界面

• 发表时间: 2012
• 作者: Satoshi Kubo;Noritaka Nishida;Yuko Udagawa;Osamu Takarada;Shinji Ogino;Ichio Shimada;久保 智史;久保智史
• 通讯作者: 久保智史