蛋白質リジンメチル化のプロテオミクス解析システムの確立

当初以下の3つの項目の研究を計画した。1. 「メチル化リジン」を認識するモノクロナール抗体の作成とその特性の検定2. 「メチル化リジン」を認識するモノクロナール抗体を用いた新たなリジンメチル化基質の同定3. リジンメチル化プロテオーム解析の検討H22年度中に、2までに関して成果を得た。1. メチル化リジンを特異的に認識するプローブとして、特異性の異なる抗メチル化リジン抗体を複数作成し、その応用性を検討した。2. 得られた抗メチル化リジン抗体を用いて、免疫沈降ならびに質量分析により、新たなリジンメチル化を受ける蛋白質が同定可能か、検討した。具体的には、まず、既にリジンメチル化修飾の存在が明らかとなっているタンパク質EFla1をモデルとして、1.で得られたメチル化リジン特異的抗体による免疫沈降が可能か、検討した。その結果、EFla1のメチル化部位である55番目のリジン残基をアルギニンに置換したK55Aと町のEFla1を293T細胞に過剰発現し、その細胞抽出液を用いた免疫沈降実験を行った。結果、特異抗体はK55AよりもwtのEFla1を有意に免疫沈降できることが明らかとなった。次に、この抗体をクロスリンクしたマグネットビーズを用いて293T細胞の細胞抽出液から免疫沈降を行った。得られた免疫沈降物の質量分析を行ったところ、複数の分子が、抗メチル化リジン抗体特異的に免疫沈降されてくること、その中にEFla1も含まれていること、いくつかの分子に関してはリジン残基のメチル化修飾の可能性が示唆された。現在、新たに検出された新規リジンメチル化候補分子に関して、さらなる検証を行っている。

当初以下の3つの項目の研究を計画した。1. 「メチル化リジン」を認識するモノクロナール抗体の作成とその特性の検定2. 「メチル化リジン」を認識するモノクロナール抗体を用いた新たなリジンメチル化基質の同定3. リジンメチル化プロテオーム解析の検討H22年度中に、2までに関して成果を得た。1. メチル化リジンを特異的に認識するプローブとして、特異性の異なる抗メチル化リジン抗体を複数作成し、その応用性を検討した。2. 得られた抗メチル化リジン抗体を用いて、免疫沈降ならびに質量分析により、新たなリジンメチル化を受ける蛋白質が同定可能か、検討した。具体的には、まず、既にリジンメチル化修飾の存在が明らかとなっているタンパク質EFla1をモデルとして、1.で得られたメチル化リジン特異的抗体による免疫沈降が可能か、検討した。その結果、EFla1のメチル化部位である55番目のリジン残基をアルギニンに置換したK55Aと町のEFla1を293T細胞に過剰発現し、その細胞抽出液を用いた免疫沈降実験を行った。結果、特異抗体はK55AよりもwtのEFla1を有意に免疫沈降できることが明らかとなった。次に、この抗体をクロスリンクしたマグネットビーズを用いて293T細胞の細胞抽出液から免疫沈降を行った。得られた免疫沈降物の質量分析を行ったところ、複数の分子が、抗メチル化リジン抗体特異的に免疫沈降されてくること、その中にEFla1も含まれていること、いくつかの分子に関してはリジン残基のメチル化修飾の可能性が示唆された。現在、新たに検出された新規リジンメチル化候補分子に関して、さらなる検証を行っている。