7回膜受容体シグナル伝達機構解析のための新規バイオセンサーの開発

开发用于分析7膜受体信号转导机制的新型生物传感器

• 批准号: 11J02292
• 负责人: 中村 泰之
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02292/
• 关键词: G蛋白質共役型受容体; 酵母2ハイブリット; タンパク質間相互作用; 二量体化; シグナル伝達; ダイマー化

7回膜貫通型構造を有するG蛋白質共役型受容体(GPCR)は、外部からのリガンド刺激に応答し、シグナルを伝達することで多様な生理活性を制御している。そのため、GPCRは創薬の主要なターゲットとして君臨してきたが、市場におけるシェアは徐々に減衰してきている。こうした背景から、GPCRに対する新たな作用機序を介した医薬品開発が求められており、GPCRシグナル伝達の多様性を生み出す要因と目されているヘテロニ量体形成機構の解明はきわめて重要な課題となっている。そこで本研究では、GPCRの二量体形成とシグナル伝達の関連を明らかにするためのシステムを構築することを目的とした。前年度までに本研究では遠赤色蛍光蛋白質E2-Crimsonを二量体検出用レポーターとして、緑色蛍光蛋白質EGFPをシグナル伝達検出用レポーターとして使用し、酵母GPCRやヒトGPCRであるソマトスタチンレセプターの二量体形成とシグナル伝達の同時検出に成功してきた。そこで本年度はシステムの汎用性を高めるためにシグナル伝達検出用レポーターであるEGFPを4量体構造をとるZoanthus sp.由来ZsGreenに置換し、さらに酵母/ヒトキメラ型G蛋白質を導入することで検出システムの改良を行った。従来系では解析が困難であったヒトGPCRであるセロトニンレセプターを高感度検出システムで解析した結果、二量体形成・シグナル伝達ともに検出することに成功した。これにより、応用できるGPCRの種類の拡充に成功したことから、さらなるGPCRのヘテロ二量体形成における解析が可能であると示唆される。さらに本年度は蛍光より簡便なグロースアッセイ系を基盤とした、GPCRの二量体化によりレポーターが発現すると細胞死に至るシステムの構築に成功した。これにより、GPCRの二量体化の阻害を酵母の増殖能の回復を指標として検出することが可能となり、二量体化阻害剤を簡便にスクリーニングすることが可能であると示唆される。本研究で開発したシステムはGPCRの機能・構造解析や薬物スクリーニングなどに有用なツールとなることが期待される。

G蛋白偶联受体（GPCR）具有七个跨膜结构对外部配体刺激的反应并发射信号以调节各种生理活性。结果，GPCR已成为药物发现的主要目标，但其市场份额逐渐下降。鉴于这种背景，需要通过对GPCR的新作用机理进行药物开发，并阐明异观测物形成机制，这被认为是在GPCR信号传导中产生多样性的因素，这是一个极为重要的问题。因此，本研究旨在构建一个系统，以阐明GPCR二聚体形成与信号转导之间的关系。直到上一年，这项研究都将远红色的荧光蛋白E2-Crimson用作二聚体检测的报告基因和绿色荧光蛋白EGFP作为信号转导检测的记者，并成功地检测到了二聚体形成和二聚体受体的信号转导的生长抑制剂受体，酵母受体，Yeast GPCR和人类GPCR和人类GPCR。因此，在今年，为了提高系统的多功能性，EGFP（用于检测信号传导的记者）被衍生自Zoanthus sp。的Zsgreen代替，该Zsgreen具有四聚体结构，并进一步引入了酵母/人类嵌合G蛋白，以改善检测系统。使用高敏感检测系统的常规系统难以分析的5-羟色胺受体的分析已成功地检测二聚体形成和信号传导。这表明可以进一步分析GPCR的异二聚体形成，因为它已经成功地扩展了可以使用的GPCR类型。此外，今年，我们已经成功地构建了一个基于生长测定系统的系统，该系统比荧光更简单，并且当通过GPCR的二聚化表达记者时，可能导致细胞死亡。这使得可以使用酵母作为指示器的增殖能力的恢复来检测GPCR二聚化的抑制作用，这表明可以轻松筛选二聚化抑制剂。这项研究中开发的系统有望是用于GPCR和药物筛查功能和结构分析的有用工具。

项目成果

ヒト受容体リガンド探索のための酵母蛍光レポーター高感度アッセイシステムの開発とその応用

用于人类受体配体发现的高灵敏度酵母荧光报告分析系统的开发及其应用

• 发表时间: 2013
• 作者: 中村泰之;石井純;近藤昭彦
• 通讯作者: 近藤昭彦

神戸大学バイオ生産工学研究室(近藤研究室)ホームページ

神户大学生物制造工程实验室（近藤实验室）主页

Rapid, Facile Detection of Heterodimer Partners for Target Human G-Protein-Coupled Receptors Using a Modified Split-Ubiquitin Membrane Yeast Two-Hybrid System.

• DOI: 10.1371/journal.pone.0066793
• 发表时间: 2013
• 期刊: PloS one
• 影响因子: 3.7
• 作者: Nakamura Y;Ishii J;Kondo A
• 通讯作者: Kondo A

G蛋白質共役型受容体の二量体形成およびシグナル伝達の同時解析システム

G蛋白偶联受体二聚体形成和信号转导同步分析系统

• 发表时间: 2013
• 作者: 竹本紀加;中村泰之;石井純;近藤昭彦
• 通讯作者: 近藤昭彦

Bright fluorescence monitoring system utilizing Zoanthus sp. green fluorescent protein (ZsGreen) for human G-protein-coupled receptor signaling in microbial yeast cells.

• DOI: 10.1371/journal.pone.0082237
• 发表时间: 2013
• 期刊: PloS one
• 影响因子: 3.7
• 作者: Nakamura Y;Ishii J;Kondo A
• 通讯作者: Kondo A