メタボローム解析に基づくANAMMOXプロセスの高効率・安定化技術の創出

基于代谢组分析创建厌氧氨氧化工艺的高效稳定技术

基本信息

批准号：
11J04128
负责人：
押木守
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J04128/
关键词：
anammox Brocadia sinica プロテオーム鉄酸化硝酸還元窒素除去ゲノム

项目摘要

本年度は"Candidatus Brocadia sinica"のプロテオーム解析のデータについて詳細な解析を行い、細胞内代謝マップの作成を行った。代謝マップ解析ではKEGG、Breda等のデータベースを用いて解析を行い、文献レビューを加えることで各代謝経路の成り立ちを考察した。主要な代謝経路として、嫌気性アンモニア酸化(anammox)、無機炭酸の固定に利用される還元的acetyl CoA経路、還元力生成のための亜硝酸酸化経路を同定することに成功した。特にanammox経路に関与するヒドラジン酸化酵素とヒドラジン合成酵素の発現量が"Ca. Brocadia sinica"の細胞内で極めて高く、主たるエネルギー生産経路となっていたことが明らかとなった。さらに、NrfAの発現がプロテオームから確認されており、これは"Ca. Brocadia sinica"が異化的硝酸還元を行っていた事を示唆する結果だった。"Ca. Brocadia sinica"による異化的硝酸還元を実証するため、細胞に硝酸とギ酸を添加し、嫌気的に培養し、亜硝酸とアンモニアの生成を同位体比分析で調査した。その結果、亜硝酸とアンモニアの生成を確認することができ、"Ca. Brocadia sinica"の新たな生理学的特性を明らかにすることに成功した。一方、興味深いことに亜硝酸還元を担う酵素がゲノム上からも見いだされなかった。そこで、亜硝酸還元酵素を同定すべくRadboud大学(オランダ)に留学し、タンパク質精製の研究に取り組んだ。細胞粗抽出液から亜硝酸還元活性を示すフラクションを確認し、段階的に精製することに成功した。一連の解析を通じて、"Ca. Brocadia sinica"の新たな生理学的特性を明らかにすることに成功したと言える。こうした解析の経過について論文誌において報告を行った。

今年，我们对“西尼卡念珠菌”的蛋白质组分析数据进行了详细分析，并创建了一个细胞内代谢图。使用诸如KEGG和Breda之类的数据库进行了代谢地图分析，并添加了文献综述以检查每个代谢途径的起源。我们已经成功鉴定了主要的代谢途径：Anammox，用于固定无机碳酸的还原性乙酰基COA途径，以及用于生产还原力的亚硝酸盐氧化途径。据揭示，与Anammox途径有关的氢氮酶氧化酶和氢氮合酶的表达水平在“西尼卡大约”的细胞中极高，使其成为主要的能源生产途径。此外，从蛋白质组中证实了NRFA的表达，这表明“西尼卡大约”经过了硝酸盐的减少。为了证明“西尼卡大约”的硝酸盐降低分解代谢，用硝酸和甲酸加入细胞，厌氧培养，并通过同位素比分析研究了亚硝酸盐和氨的形成。结果，确认了亚硝酸盐和氨的形成，并成功地揭示了“西尼卡大约”的新生理特性。有趣的是，在基因组中没有发现负责亚硝酸盐还原的酶。因此，我在拉德布德大学（荷兰）出国学习，以识别亚硝酸盐还原酶并研究蛋白质纯化的研究。从粗细胞提取物中证实了表现出亚硝酸盐还原活性的馏分，并在阶段成功纯化了馏分。通过一系列分析，可以说，他们成功地揭示了“西尼卡大约”的新生理特性。该分析的进度在杂志上报道了。