N型糖鎖修飾を受けない膜貫通型タンパク質の品質管理に関する研究

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ヒトGタンパク質共役型受容体(GPCR)823種についてデータベース検索を行い、その内の53種がN型糖鎖修飾モチーフであるN-x-S/T配列を細胞外領域に有していないことを見出した。その53種のうち42種については、稀に糖鎖修飾が行われるN-x-C配列をも有していないことが判明した。N-x-S/T/Cモチーフを含まないGPCRのうち、ヒトα2Bアドレナリン受容体(ADRa2B)を含む6種類のGPCRに対して遺伝子クローニングを行った。これらを培養細胞株に過剰発現させてウェスタンブロット法(WB)により分子量を測定したところ、構成アミノ酸数から予測される位置にシャープなバンドが確認された。すなわちN-x-S/T/Cモチーフを有していないGPCRが糖鎖修飾を受けていないことを確認した。フローサイトメトリー及び共焦点レーザー顕微鏡を用いてこれらのGPCRの細胞内局在を確認したところ、糖鎖修飾を受けずとも正しく膜発現しているGPCRも存在していることが確認された。膜発現が良好に観察されたADRa2Bについて構造異常型であるC164A(分子内ジスルフィド結合を形成できない変異体)を作製した。C164Aはwtと比較して細胞膜表面への発現が減少しており、小胞体に局在していることが観察された。WBによりそれぞれの定量を行ったところ、C164Aの総タンパク量はwtと比較して減少していた。プロテアソーム阻害剤であるMG132やラクタシスチンで細胞を処理するとこの差がなくなったことから、構造異常型がプロテアソームで分解されていることが示唆された。免疫沈降法によりADRa2Bのユビキチン化を検出したところ、C164Aはwtと比較してよりユビキチン化されていることを見出した。以上の結果から糖鎖修飾を受けないGPCRに対して、(1)糖鎖を介さない小胞体品質管理機構が存在していること(2)構造異常を起こした場合にユビキチン-プロテアソーム系によって分解を行っていることが強く示唆された。