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N型糖鎖修飾を受けない膜貫通型タンパク質の品質管理に関する研究

不发生N-糖基化的跨膜蛋白的质量控制研究

基本信息

批准号：
11J04413
负责人：
井村祐己
金额：
$ 0.45万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトGタンパク質共役型受容体(GPCR)823種についてデータベース検索を行い、その内の53種がN型糖鎖修飾モチーフであるN-x-S/T配列を細胞外領域に有していないことを見出した。その53種のうち42種については、稀に糖鎖修飾が行われるN-x-C配列をも有していないことが判明した。N-x-S/T/Cモチーフを含まないGPCRのうち、ヒトα2Bアドレナリン受容体(ADRa2B)を含む6種類のGPCRに対して遺伝子クローニングを行った。これらを培養細胞株に過剰発現させてウェスタンブロット法(WB)により分子量を測定したところ、構成アミノ酸数から予測される位置にシャープなバンドが確認された。すなわちN-x-S/T/Cモチーフを有していないGPCRが糖鎖修飾を受けていないことを確認した。フローサイトメトリー及び共焦点レーザー顕微鏡を用いてこれらのGPCRの細胞内局在を確認したところ、糖鎖修飾を受けずとも正しく膜発現しているGPCRも存在していることが確認された。膜発現が良好に観察されたADRa2Bについて構造異常型であるC164A(分子内ジスルフィド結合を形成できない変異体)を作製した。C164Aはwtと比較して細胞膜表面への発現が減少しており、小胞体に局在していることが観察された。WBによりそれぞれの定量を行ったところ、C164Aの総タンパク量はwtと比較して減少していた。プロテアソーム阻害剤であるMG132やラクタシスチンで細胞を処理するとこの差がなくなったことから、構造異常型がプロテアソームで分解されていることが示唆された。免疫沈降法によりADRa2Bのユビキチン化を検出したところ、C164Aはwtと比較してよりユビキチン化されていることを見出した。以上の結果から糖鎖修飾を受けないGPCRに対して、(1)糖鎖を介さない小胞体品質管理機構が存在していること(2)構造異常を起こした場合にユビキチン-プロテアソーム系によって分解を行っていることが強く示唆された。

There are 823 kinds of GPCRs, 53 kinds of GPCRs and N-type GPCRs in the extracellular domain. There are 53 kinds of sugar lock modifications, 42 kinds of sugar lock modifications, and N-x-C combinations. N-x-S/T/C switch includes GPCR switch, α2B switch, ADRa2B switch, and 6 types of GPCR switch. The molecular weight of the cultured cell line was determined by WB method, and the molecular weight of the cell line was determined by WB method. GPCR is a sugar lock modification process that can be verified by N-x-S/T/C. The presence of GPCR in the cell was confirmed by microscopy. The membrane development was well observed in ADRa2B, and the structural anomaly C164A (intramolecular bond formation) was controlled. C164A has been found to be less active on the surface of the cell membrane than on the surface of the cell membrane. WB is a quantitative analysis of C164A and C164A. MG132: Cell processing, structural anomaly, decomposition ADRa2B is A new type of immune system. The above results show that: (1) there is a mechanism for the quality control of small cells in the presence of sugar lock modification;(2) there is a mechanism for the structural abnormality; and (3) there is a mechanism for the decomposition of sugar lock modification.