微小管結合タンパク質Alp14の機能解析及び細胞周期依存的な局在変化機構の解明

微管相关蛋白Alp14的功能分析及细胞周期依赖性定位变化机制的阐明

• 批准号: 11J06026
• 负责人: 岡田 直幸
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J06026/
• 关键词: 微小管; 細胞周期; 微小管結合タンパク質; CDK; 局在制御機構

私はスピンドル微小管が形成されるメカニズムの解明を目指し、微小管結合タンパク質の局在制御機構に注目した。分裂酵母の微小管結合タンパク質であるAlp7-Alp14複合体は分裂期に核蓄積し、スピンドル微小管形成に寄与する。私はこの核蓄積がいかに達成されるのか解析を行った。前年度までに、Alp7-Alp14の分裂期核蓄積にAlp7のCDKによるリン酸化が重要である示唆的なデータが得られ、そのリン酸化候補アミノ酸を特定した。この5箇所を非リン酸化型に置換したalp7-5A変異体を取得し、Alp7-5Aの分裂期核蓄積が観察されないことを確認していた。本年度は、まず5Aタンパク質にNLS(核輸送シグナル)を付加したところ、5A変異体で観察された温度感受性が抑圧され、分裂期の障害はAlp7が核蓄積しないことに起因することが証明された。続いて生体内でリン酸化が起きるのか確認するため、野生型および変異体細胞よりAlp7, Alp7-5Aタンパク質を抽出し、泳動およびウエスタンブロッティングによりそのバンドシフトの有無を確認した。この結果、分裂期抽出液中のAlp7はリン酸化と思われるバンドシフトが見られたが、間期のAlp7はバンドシフトが確認されなかった。またAlp7-5Aにおいては間期、分裂期ともにバンドシフトは検出されなかった。すなわち、Alp7の5箇所のリン酸化候補残基は生体内でもリン酸化を受けていた。このリン酸化の意義を追究するため、核輸送担体であるCut15とAlp7およびAlp7-5Aの相互作用の検出を出芽酵母ツーハイブリッド法により試みた。この結果、Alp7とCut15に相互作用が検出され、この相互作用はAlp7-5Aで低下していた。以上の結果から、Alp7がCDKによりリン酸化を受け、Cut15との相互作用を介して分裂期に核蓄積し、スピンドル微小管形成を補佐することがわかった。

Private は ス ピ ン ド ル が tiny tube forming さ れ る メ カ ニ ズ ム の interpret を refers し, tiny tube combined with タ ン パ ク qualitative の bureau in the system of imperial institutions に attention し た. Tiny tube combined with split yeast の タ ン パ ク qualitative で あ る Alp7 - Alp14 complex は divide に nuclear accumulation し, ス ピ ン ド ル tiny tube forming に send and す る. Private が <s:1> <s:1> nuclear accumulation が が に に achieve される が った explanation を line った. Before the annual ま で に, Alp7 Alp14 の divide nuclear accumulation に Alp7 の CDK に よ る リ ン acidification が important で あ る of sucking な デ ー タ が must ら れ, そ の リ ン acidification alternate ア ミ ノ acid を specific し た. こ の five を non リ ン acidification に substitutional し た alp7-5 - a - variant を し, alp7-5 a の divide nuclear accumulation が 観 examine さ れ な い こ と を confirm し て い た. This year は, ま ず 5 a タ ン パ ク qualitative に NLS (nuclear transport シ グ ナ ル) を plus し た と こ ろ, 5 a - variant で 観 examine さ れ た temperature sensitivity が 圧 suppression さ れ, divide の handicap of は Alp7 が nuclear accumulation し な い こ と に cause す る こ と が prove さ れ た. 続 い て in raw で リ ン acidification が up き る の か confirm す る た め, wild type お よ び - variant cells よ り Alp7, Alp7-5 a タ ン パ ク を drew し, swimming お よ び ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り そ の バ ン ド シ フ ト の presence of を confirm し た. こ の results, divided period in extract の Alp7 は リ ン acidification と think わ れ る バ ン ド シ フ ト が see ら れ た が, interphase の Alp7 は バ ン ド シ フ ト が confirm さ れ な か っ た. ま た Alp7-5 a に お い て は stage between, divided と も に バ ン ド シ フ ト は 検 out さ れ な か っ た. The リ リ acidified candidate residues of すなわち and Alp7 <s:1> are acidified を in the <s:1> organism by で リ リ <s:1> acidified を and けて た た. す こ の リ ン acidification の meaning を investigated る た め, nuclear supporter で あ る Cut15 と Alp7 お よ び Alp7-5 a の interaction の 検 out を budding yeast ツ ー ハ イ ブ リ ッ ド method に よ り try み た. The <s:1> <s:1> result, Alp7とCut15に interaction が検 results in され, the <s:1> <s:1> interaction て alp7-5a で is low, and the て て た た た. の above results か ら, Alp7 が CDK に よ り リ ン acidification を け, Cut15 と の を interface interaction between し て divide に nuclear accumulation し, ス ピ ン ド ル tiny tube forming を fill with す る こ と が わ か っ た.

项目成果

Spatial control of the microtubule-associated complex Alp7/TACC-Alnp14/TOG

微管相关复合物 Alp7/TACC-Alnp14/TOG 的空间控制

• 发表时间: 2013
• 作者: Takuya Morishita;Kazumasa Uehara;Kozo Funase;守下卓也;東 信太朗;片岡祐介;片木和彦;Naoyuki Okada
• 通讯作者: Naoyuki Okada