新規ポリユビキチン鎖の構造および形成機構の解明

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新規直鎖ポリユビキチン鎖の立体構造解析過去二年間の研究で、ポリユビキチン鎖は鎖長依存的に熱力学的安定性が低下していることが明らかになった。さらに、ポリユビキチン鎖は熱変性ならびに力学的応力により繊維形成することを発見した。また、細胞内でも鎖長依存的に凝集体形成をすることが観察された。今年度、より詳細な解析を行なった。-定量的力学的応力による繊維形成解析-繊維形成を齎す力学的応力をより定量的に解析するためCouette cellを用いた実験を行なった。Couette cellでは分子に一様かつ一方方向から力を加えることが出来る。解析の結果、ポリユビキチン鎖は47～60s~<-1>のせん断力で繊維を形成した。これは、アミロイドβ等の他の繊維形成タンパク質が繊維形成するせん断力と同程度であることが分かった。-細胞内ポリユビキチン鎖凝集体の分解-東京都医学総合研究所の小松先生との共同研究により細胞内凝集体の分解の有無を調べた。野生型マウス胎児線維芽(MEF)細胞内では凝集体は24時間でほぼ全量分解された。一方、オートファジー欠損MEF細胞内ではほとんど分解されなかった。よって細胞内ポリユビキチン鎖凝集体はオートファジーにより特異的に分解されることが分かった。長鎖ポリユビキチン鎖形成E3リガーゼLU8ACのポリユビキチン形成機構に関する構造学的研究昨年度結晶化に用いた試料を詳細に調べたところ、LUBACの構成要素であるHOIPはHOIL-1Lとの複合体に比べ単体の方が、より結晶化しやすい性質があることが分かった。本年度はHOIP単体の発現系構築、結晶化そしてX線回折実験に取り組んだ。放射光科学研究施設Photon FactoryにおいてX線回折実験を行なったところ最大解像度3.8Åの回折が得られたが、データの質が悪く構造解析には不十分であった。結晶の結晶性やクライオプロテクタントの適合性が不十分であったと考えられ、更なる結晶化・クライオプロテクタント条件を探索する予定である。